【摘 要】
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目的:观察RELM-β对低氧性肺动脉高压（Hypoxic pulmonary hypertension,HPH）的影响,并探讨Ca2+/PKC/ERK MAPK通路是否通过上调细胞周期蛋白参与该过程的作用机制,从而诱导肺动脉平滑肌细胞增殖（Pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMCs）情况。方法:动物实验:观察RELM-β基因敲除对低氧大鼠肺血管形态、血
【基金项目】
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国家自然科学基金资助（编号:81570052）RELM-β介导信号通路在低氧性肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用及机制研究；
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目的:观察RELM-β对低氧性肺动脉高压（Hypoxic pulmonary hypertension,HPH）的影响,并探讨Ca2+/PKC/ERK MAPK通路是否通过上调细胞周期蛋白参与该过程的作用机制,从而诱导肺动脉平滑肌细胞增殖（Pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMCs）情况。方法:动物实验:观察RELM-β基因敲除对低氧大鼠肺血管形态、血流动力学及肺组织中RELM-β、PKC、ERK1/2表达的影响。取野生型（Wild type,WT）和RELM-β基因完全敲除型(RELM-β-/-)两种SD雄性大鼠,将大鼠分别在常压常氧（21%O2浓度）条件（Normoxia,H0）和每日持续8小时暴露在慢性常压低氧（10%O2浓度）,不间断连续21天（Hypoxia 21days,H21）的条件下进行培育,构建出HPH大鼠模型。将其分为四组,每组五只,分组为:H21+WT、H21+RELM-β-/-、H0+WT、H0+RELM-β-/-。该实验中,测量大鼠平均肺动脉压（Mean pulmonary arterial pressure,m PAP）采用右心导管法;右心室肥厚指数（Right ventricular hypertrophy index,RVHI）采用称重法,其公式为RVHI=RV/LV+S,以此指标来进行HPSR观察;观察肺动脉重塑程度用肺动脉壁厚度与血管外直径的比值（WT%）来表示;蛋白免疫印迹（Western blot,WB）法测定RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2在肺组织中表达情况;实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q PCR）测定RELM-β的m RNA在肺组织中相对表达。细胞实验:检测野生型和RELM-β基因敲除型大鼠PASMCs缺氧状态下RELM-β、Ca2+浓度、p-PKC、p-ERK1/2、cyclin D1/E及CKD2/4蛋白含量,RELM-β经Ca2+/PKC/ERK MAPK对细胞周期及PASMCs增殖的调控作用。从RELM-β-/-与WT大鼠中分离、提取原代PASMCs,并分别行低氧（把细胞放入1%O2,94%N2,5%CO2的三气培养箱中孵育24h）和常氧（把细胞放入21%O2,74%N2,5%CO2的培养箱中孵育）干预。细胞分组:H21+WT、H21+RELM-β-/-、H0+WT、H0+RELM-β-/-。选取H21+WT组对信号分子表达情况进行检测,同时研究PASMCs增殖的调控作用,通过加入信号通路相关因子抑制剂,检测下游因子磷酸化及PASMCs增殖情况来验证。抑制剂分别为:Ca2+内外螯合剂（BAPTA-AM+EGTA）、PKC抑制剂（LY317615）。用WB法测定PASMCs中RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2、cyclin D1/E及CKD2/4蛋白表达水平;q PCR测定细胞中RELM-β的m RNA相对表达量;用Ed U免疫荧光法测定细胞增殖情况;用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞中Ca2+浓度。结果:动物实验:H21+WT组大鼠m PAP、RVHI、WT%指标及肺组织中RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2表达均高于H0+WT、H21+RELM-β-/-（P＜0.05）;H21+RELM-β-/-与H0+RELM-β-/-比较,大鼠m PAP、RVHI、WT%指标及肺组织中p-PKC、p-ERK1/2表达均上调（P＜0.05）;H0+WT组m PAP、RVHI、WT%与H0+RELM-β-/-两者间无统计学意义（P＞0.05）;H0+WT组肺组织中RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2表达均高于H0+RELM-β-/-组大鼠（P＜0.05）。细胞实验:H21+WT组PASMCs中RELM-β、Ca2+浓度、p-PKC、p-ERK1/2、cyclin D1/E、CKD2/4细胞增殖比率均高于H21+RELM-β-/-组、H0+WT组（P＜0.05）;H21+RELM-β-/-组中Ca2+浓度、p-PKC、p-ERK1/2、cyclin D1/E、CKD2/4、细胞增殖比率均高于H0+RELM-β-/-组（P＜0.05）;H0+WT组中RELM-β、p-PKC、p-ERK1/2、cyclin D1/E、CKD2/4均高于H0+RELM-β-/-组（P＜0.05）;H0+WT组与H0+RELM-β-/-组间细胞增殖比率相比差异无显著性（P＞0.05）。添加信号通路相关蛋白抑制剂后,与对照组比较细胞增殖减弱,相关下游通路蛋白及cyclin D1/E、CKD2/4表达均减少（P＜0.05）。结论:低氧时刺激RELM-β经Ca2+/PKC/ERK MAPK通路促进周期蛋白表达,诱导PASMCs增殖,参与了HPSR和HPH的形成。
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