论文部分内容阅读
目的:非小细胞肺癌发病率及病死率居恶性肿瘤之首。铂类药物特别是顺铂(cis-diammine-dichloroplatinum,DDP)广泛应用于临床,但会产生耐药。程序性细胞死亡因子配体-1(Programmed death factor ligand-1,PD-L1)具备多种生物学效应,但在顺铂耐药非小细胞肺癌中的作用未完全阐明。本文旨在探讨PD-L1调控顺铂耐药非小细胞肺癌转移及逃逸NK细胞肿瘤免疫的功能意义。方法:通过用小剂量顺铂长期反复刺激非小细胞肺癌A549和H157亲本细胞株(A549P和H157P),培育顺铂耐药非小细胞肺癌细胞株(A549Cis R和H157Cis R)。通过Western Blot、q PCR、免疫荧光、流式细胞技术检测ATM、MEK/ERK、JAK1,2/STAT3、FASN、TGF-β1、PD-L1等多种基因m RNA转录及蛋白翻译。通过慢病毒转染si RNA基因沉默或过表达、中和抗体、蛋白分子抑制剂、人重组蛋白多种方法增强或降低ATM、MEK/ERK、JAK1,2/STAT3、FASN、TGF-β1、PD-L1等多种蛋白表达。通过MTT实验、划痕实验、Transwell迁移侵袭实验测定细胞增殖、迁移和侵袭。通过从健康人外周血(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分离的自然杀伤细胞(Natural Killer Cell,NK Cell)及NK-92细胞系与肿瘤细胞共培养模拟肿瘤微环境。通过LDH定量检测、流式细胞术、单细胞克隆形成实验研究不同情况下NK细胞对肺癌细胞的免疫查杀。最后,通过肿瘤异种移植小鼠模型研究肿瘤转移,通过注射荧光素的活体图像系统(IVIS)检测肿瘤生长转移,通过免疫组化检测肿瘤异种移植小鼠模型中相应蛋白的表达情况。结果:顺铂耐药非小细胞肺癌细胞对顺铂的IC50比亲本细胞高6-8倍,确定成功构建顺铂耐药非小细胞肺癌细胞株。顺铂耐药非小细胞肺癌细胞较亲本细胞显著低表达钙黏蛋白E(E-cadherin),显著高表达钙黏蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Twist、VEGF和Snail,迁移和侵袭能力显著增强,较亲本细胞表现出更强的上皮间质转化和转移潜能。ATM/JAK1,2/STAT3基因信号通路位于上游正向调控PD-L1表达,在顺铂耐药非小细胞肺癌细胞显著高表达,调控上皮间质转化和转移潜能。肿瘤异种移植小鼠模型研究结果及免疫组化染色结果与细胞实验结果一致,顺铂耐药非小细胞肺癌通过EMT促进转移。与亲本细胞相比,顺铂耐药非小细胞肺癌细胞可以显著逃逸NK细胞的肿瘤免疫查杀,与其高表达PD-L1有关。顺铂耐药非小细胞肺癌细胞与NK细胞共培养后可以诱导NK细胞表达PD-1促进顺铂耐药非小细胞肺癌细胞逃逸NK细胞肿瘤免疫,亲本细胞则不具有该功能。MEK/ERK/PD-L1信号通路及FASN-TGF-β1-PD-L1正反馈闭合环特异性存在于顺铂耐药非小细胞肺癌细胞,促进逃逸NK细胞的肿瘤免疫细胞查杀。与PD-1/PD-L1负性免疫调控点作用功能相反的NKG2D配体包括ULBP1、ULBP2、ULBP3、MICA和MICB与NKG2D构建NKG2DL/NKG2D正性免疫调控点,亦接受MEK/ERK基因信号通路以及FASN-TGF-β1正反馈通路闭合环的调控。运用TGF-β1抑制剂或ERK抑制剂与Anti-PD-L1中和抗体联合免疫治疗法逆转顺铂耐药非小细胞肺癌细胞逃逸NK细胞肿瘤免疫的效果优于单一用药。结论:PD-L1在顺铂耐药非小细胞肺癌中显著高表达,促进细胞上皮间质转化、转移及逃逸NK细胞肿瘤免疫。ATM/JAK1,2/STAT3、MEK/ERK及FASN-TGF-β1基因信号通路位于上游正性调控PD-L1表达,靶向抑制上述基因信号通路可以显著逆转顺铂耐药非小细胞肺癌上皮间质转化、转移及逃逸NK细胞肿瘤免疫。运用TGF-β1抑制剂或ERK抑制剂与Anti-PD-L1中和抗体联合免疫治疗法逆转顺铂耐药NSCLC逃逸NK细胞肿瘤免疫的效果优于单一用药。