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背景:姜黄素(Curcumin)是从植物姜黄中分离出来具有抗炎、抗氧化等多种药理活性的天然多酚,具有潜在的临床价值。因姜黄素水溶解性差,口服生物利用度低,极大限制其临床应用。我们通过构建聚乙二醇修饰后的姜黄素衍生物(Curc-mPEG454),明显改善姜黄素的水溶性和生物利用度。前期研究证实Curc-mPEG454减轻肝纤维化程度与显著抑制环氧合酶2(COX-2)表达密切相关。因此,本研究采用脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7作为炎症模型,以姜黄素、阿司匹林、NS-398和维生素C做对照,在体外系统评估Curc-mPEG454抗炎和抗氧化活性,并阐明其可能的分子作用机制。材料与方法:1.细胞模型和分组:用含10%血清的DMEM培养基培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,待细胞状态良好时将细胞分为七组:正常对照组,LPS模型组,CurcmPEG454(16μM),姜黄素(16μM),阿司匹林(100μM),NS-398(50μM)和维生素C(300μM)预处理2h,随后,除正常对照组外,其余各组均用1μg/ml脂多糖(LPS)刺激细胞24小时。2.炎症因子的检测:ELISA检测各组细胞上清中炎症因子的含量,包括白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)。荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测环氧合酶-2(COX-2)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素1β(IL-1β)和一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的表达水平。Western Blot检测COX-2和iNOS的蛋白表达水平。3.ROS的检测:DCFH-DA标记细胞内的ROS,使用激光共聚焦和流式细胞术检测各组细胞活性氧类的(ROS)水平。4.抗氧化活性的检测:的蛋白和mRNA的表达。酶活性检测试剂盒和PCR检测了细胞中抗氧化酶类,包括血红素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)酶的活性以及他们的mRNA表达水平。5.核转录因子的检测:Real-Time PCR和Western Blot分别检测(NF-κB),-c-Jun的核蛋白和mRNA的表达水平,同时应用激光共聚焦技术检测NF-κB p65的和转位情况和p-c-Jun核内表达的情况。6.统计所有实验数据,以平均数±标准差表示,采用SPSS19.0软件中的单因素方差分析组间数据是否具有差异性,当P<0.05认为组间差异具有统计学意义。结果:1.Curc-mPEG454抑制炎症介质的释放:Curc-mPEG454(IC50 57.8μM)与姜黄素(IC50 32.6μM)相比,其细胞毒性较低,并呈浓度依赖性抑制炎性细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和MCP-1的释放。在相同浓度下,16μM CurcmPEG454也显示出比姜黄素更强的对炎症细胞因子的抑制作用(P<0.05)。2.Curc-mPEG454显著下调COX-2表达,减少PEG2生成:LPS诱导升高细胞COX-2的表达量,而Curc-mPEG454(16μM)最能够抑制COX-2蛋白和mRNA的表达继而抑制前列腺素E2(PGE2)的产生,却不影响COX-2酶的活性。阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)能够明显降低PGE2的水平,主要通过抑制COX-2酶的活性但并不显著改变COX-2的表达水平。3.Curc-mPEG454抑制NF-κB p65核转位和降低p-c-jun水平。在模型组中LPS诱导细胞内NF-κB p65核转位和p-c-jun的表达水平升高,与模型组比较,细胞核内的荧光结果显示Curc-mPEG454(16μM)明显减少LPS诱导的NF-κB p65核转位和p-c-jun磷酸化水平。而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)轻微减少了NF-κB p65核转位和p-c-jun的表达水平。Curc-mPEG454降低LPS诱导的NF-κB p65核转位和p-c-jun的表达水平是最为明显的。4.Curc-mPEG454抑制LPS诱导的iNOS表达,NO和ROS产生:CurcmPEG454(16μM)能明显降低LPS诱导的iNOS的产生并抑制NO和ROS的生成,而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)则并不能降低LPS诱导的ROS和NO的产生。而Curc-m PEG454(16μM)和Curcumin(16μM)的抑制效果基本相同。5.Curc-mPEG454通过激活Nrf2及下游抗氧化酶类发挥抗氧化作用:CurcmPEG454(16μM)在6h、12h、24h三个时间点对Nrf2核蛋白和mRNA的表达呈先升高后下降的趋势。在炎症的早期,Curc-mPEG454(16μM),Curcumin(16μM)和维生素C(300μM)能够通过激活Nrf2,升高其下游的抗氧化酶类HO-1,GSH,SOD,CAT的活性,而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)并不能升高Nrf2的表达和其下游的抗氧化酶的活性。Curc-mPEG454具有和Curcumin、维生素C等同的抗氧化能力。结论:Curc-mPEG454通过抑制NF-κB p65核移位,抑制c-Jun磷酸化和抑制COX-2的表达发挥抗炎作用。其次,Curc-mPEG454通过增加Nrf2的表达,升高其下游的HO-1,GSH,SOD,CAT等抗氧化酶系统发挥抗氧化作用。聚乙二醇化姜黄素不仅改善姜黄素的水溶性,提高其生理活性,而且作用于炎症反应和抗氧化反应的的多个靶点,其抗炎效果优于阿司匹林和NS-398,抗氧化能力等同维生素C。