论文部分内容阅读
类风湿性关节炎(RA)是一种伴随着关节软骨退化的慢性系统性自身免疫性疾病,细胞焦亡作为其发生的一个原因而备受关注。前期研究结果表明在大鼠关节软骨细胞中胞外酸化能通过激活NLRP3炎症小体来介导软骨细胞发生焦亡。然而，胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞发生焦亡的具体机制目前尚不清楚。酸敏感离子通道属于一类阳离子通道，由胞外酸化所激活的。大量文献研究表明：在关节炎中，胞外酸化能够通过激活ASICs上调calpain和calcineurin的表达。研究表明：calpain、calcineurin与细胞焦亡密切相关，而软骨细胞胞外酸化过程中是否存在着ASIC1a介导的细胞焦亡，以及ASIC1a是否是通过调节calpain-2、calcineurin蛋白的表达来参与细胞焦亡目前尚不清楚。本课题通过体外实验研究胞外酸化是否是通过激活ASIC1a来介导大鼠关节软骨细胞发生焦亡，同时观察calpain-2/calcineurin通路在此过程中发挥的作用。本课题的研究内容主要分为以下四个方面： 1.体外实验研究胞外酸化对ASIC1a，calpain，calcineurin和NLRP3炎症小体的影响。 关节软骨细胞分组如下：（1）分别用含1%FBS的pH7.4、pH7.0、pH6.5和pH6.0的培养基培养各组细胞6h。（2）pH7.4正常组、pH6.0胞外酸化1h组、胞外酸化3h组、胞外酸化6h组、胞外酸化12h组和胞外酸化24h组，酸化刺激相应的时间后来收集细胞。结果表明：用不同pH酸化刺激软骨细胞6h，pH6.0条件下ASIC1a蛋白表达增加得最为显著。用pH6.0酸化刺激软骨细胞6h时ASIC1a蛋白表达达到最大值。qpcr结果显示：用pH6.0酸化刺激软骨细胞12h时calpain-1、calpain-2、calcineurin mRNA表达增加得最为显著。Western blot结果显示：用pH6.0酸化刺激软骨细胞12h时calpain-1、calpain-2、calcineurin蛋白表达与mRNA表达结果一致。qpcr结果显示：用pH6.0酸化刺激软骨细胞24h时NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表达增加得最为显著。Western blot结果显示：用pH6.0酸化刺激软骨细胞24h时NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达与mRNA表达结果一致。 以上结果表明：胞外酸化刺激可以显著上调ASIC1a、calpain、calcineurin和NLRP3炎症小体的表达。 2.体外实验研究关节软骨细胞中沉默和阻断ASIC1a对胞外酸化刺激的calpain-2、calcineurin和细胞焦亡的影响。 关节软骨细胞分组如下：pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+空质粒对照组、pH6.0+ASIC1a沉默组和pH6.0+Pctx-1(100ng/ml）组（ASIC1a特异性的抑制剂），细胞经过相应处理后再使用pH6.0的培养基酸化处理6h。实验结果表明ASIC1a shRNA处理关节软骨细胞6h时，细胞内ASIC1a、calpain-2、calcineurin、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达明显受到抑制。AO/EB结果显示，pH7.4的正常组细胞死亡数较少，pH6.0酸化组软骨细胞被染成橘黄色，着色细胞比例增加，细胞死亡明显增多，用ASIC1a shRNA处理可以明显抑制软骨细胞死亡。LDH结果显示，pH7.4的正常组细胞释放的LDH较少，pH6.0酸化组LDH释放显著增加，control shRNA组LDH释放与pH6.0酸化组无差异，用ASIC1a shRNA和PcTX1处理可以明显抑制LDH的释放。ELISA结果显示，pH7.4的正常组细胞分泌的IL-1β较少，pH6.0酸化组IL-1β分泌显著增加，control shRNA组IL-1β分泌与pH6.0酸化组无差异，用ASIC1a shRNA和PcTX1处理可以明显抑制IL-1β的分泌。 以上结果表明：阻断ASIC1a能够抑制胞外酸化刺激的calpain-2，calcineurin蛋白表达的升高以及酸化刺激诱导的关节软骨细胞的焦亡。 3.体外实验研究关节软骨细胞中沉默和阻断calpain-2对胞外酸化刺激的calcineurin和细胞焦亡的影响。 关节软骨细胞分组如下：pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+空质粒对照组、pH6.0+calpain-2沉默组和pH6.0+calpain-2抑制剂calpeptin组，细胞经过相应处理后再使用pH6.0的细胞培养基酸化处理12h。实验结果表明calpain-2 shRNA处理关节软骨细胞12h时，细胞内calpain-2、calcineurin、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达明显受到抑制。AO/EB结果显示，pH7.4的正常组细胞死亡数较少，pH6.0酸化组软骨细胞被染成橘黄色，着色细胞比例增加，细胞死亡明显增多，用calpain-2 shRNA处理可以明显抑制软骨细胞死亡。LDH结果显示，pH7.4的正常组细胞释放的LDH较少，pH6.0酸化组LDH释放显著增加，control shRNA组LDH释放与pH6.0酸化组无差异，用calpain-2 shRNA和calpeptin处理可以明显抑制LDH的释放。ELISA结果显示，pH7.4的正常组细胞分泌的IL-1β较少，pH6.0酸化组IL-1β分泌显著增加，control shRNA组IL-1β分泌与pH6.0酸化组无差异，用calpain-2 shRNA和calpeptin处理可以明显抑制IL-1β的分泌。 以上结果表明：阻断calpain-2能够抑制胞外酸化刺激的calcineurin蛋白表达的升高以及酸化刺激诱导的关节软骨细胞的焦亡。 4.体外实验研究关节软骨细胞中沉默和阻断calcineurin对胞外酸化诱导的细胞焦亡的影响。 关节软骨细胞分组如下：pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+空质粒对照组、pH6.0+calcineurin沉默组和pH6.0+calcineurin抑制剂CsA组，细胞经过相应处理后再使用pH6.0的细胞培养基酸化处理12h。实验结果表明calcineurin shRNA处理关节软骨细胞12h时，细胞内calcineurin、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达明显受到抑制。AO/EB结果显示，pH7.4的正常组细胞死亡数较少，pH6.0酸化组软骨细胞被染成橘黄色，着色细胞比例增加，细胞死亡明显增多，用calcineurin shRNA处理可以明显抑制软骨细胞死亡。LDH结果显示，pH7.4的正常组细胞释放的LDH较少，pH6.0酸化组LDH释放显著增加，control shRNA组LDH释放与pH6.0酸化组无差异，用calcineurin shRNA和CsA处理可以明显抑制LDH的释放。ELISA结果显示，pH7.4的正常组细胞分泌的IL-1β较少，pH6.0酸化组IL-1β分泌显著增加，control shRNA组IL-1β分泌与pH6.0酸化组无差异，用calcineurin shRNA和CsA处理可以明显抑制IL-1β的分泌。 以上结果表明：阻断calcineurin能够抑制胞外酸化诱导的关节软骨细胞的焦亡。 综上所述，本实验的研究结果表明：在大鼠关节软骨细胞中，胞外酸化通过激活ASIC1a来诱导细胞发生焦亡，其可能机制是通过活化calpain-2/calcineurin信号通路。