大脑可依赖于其内在的保护机制来应对缺血/低氧性损伤刺激。而预先给予机体亚致死性的缺血/低氧刺激,可明显提高脑组织对缺血/低氧性损伤的耐受能力,即缺血/低氧预适应(Ischemic/hypoxic preconditioning,I/HPC)。对此现象的经典描述最早见于1986年美国学者Murry对狗心脏组织缺血预适应的研究报道。随后的研究发现,间歇性、短暂性地阻断颈动脉血流也可明显减轻后续脑缺血导致的豚鼠海马CA1区神经元的死亡,并由此引发了人们对脑缺血/低氧预适应研究的热潮。已有大量研究报道,预适应可通过缓解多种损伤机制,如兴奋性毒性、离子或pH失衡、氧化应激、代谢功能失调、炎症反应、凋亡和死亡等,起到脑保护的作用。虽然对脑I/HPC的研究已有二十多年,但其发生发展的细胞分子机制尚不清楚。关于介导I/HPC对神经保护作用的信号转导通路研究近年来取得了较大的进展。其中,蛋白激酶C(PKC)介导的信号通路受到了大家的关注。多数的研究提示,PKC介导预适应的作用具有亚型特异性。本课题组以往的研究发现,经典型PKCβⅡ(cPKCβⅡ)Ⅰ的激活可能参与了脑HPC的发生发展过程。然而,关于cPKCβⅡ是否能够介导HPC对缺血脑的保护作用,以及cPKCβⅡ在脑内相互作用蛋白形成的信号网络等问题,均有待于证实或深入研究。据此,本研究拟进一步探讨cPKCβⅡ在缺血脑保护中的作用,同时应用蛋白质组学技术,鉴定参与脑HPC形成的cPKCβⅡ相互作用蛋白,丰富人们对cPKCβⅡ信号网络的认识。　　 实验在室温20-22℃下进行,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g),动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No.80-23)进行。脑缺血实验动物分组如下:假手术组(Sham)、脑中动脉阻塞(MCAO)致脑局部缺血组(Ischemia)、预适应后缺血组(HPC+I)和预适应-抑制剂后缺血组(HPC+Go6983)。通过神经行为学评分和脑梗死体积和水肿率的分析,评价缺血小鼠脑损伤程度。然后,收集缺血核心区(I)、半影区(P)和缺血对侧皮质(C)组织,进行胞浆、膜相关或全细胞蛋白组分的提取。应用蛋白印迹(Western blot)方法,观察不同脑区皮质组织内cPKCβⅡ膜转位水平及蛋白表达量变化的影响；部分小鼠脑进行冰冻切片处理,应用Nissl染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)凋亡细胞等方法来评估神经细胞的损伤和凋亡情况。蛋白质组学分析实验中,动物分为Con组(对照)和HPC组(低氧暴露4次)。收集小鼠大脑皮层组织,分别提取胞浆和膜相关蛋白成分,利用免疫沉淀、双向电泳和质谱技术分析与cPKCβⅡ相互作用的蛋白。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理,以均数±标准误(X±S.E.)表示,其中p<0.05为差异显著。实验结果如下:　　 1.cPKβⅡ膜转位水平升高参与了HPC对MCAO致局部缺血脑的保护作用　　 本研究应用神经行为学评分,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、Nissl和TUNEL染色等指标检测TMCAO致脑局部缺血的损伤程度。实验结果表明,MCAO致脑局部缺血可引起小鼠神经行为学的明显改变,如姿势侧倾、拖地步态、转圈、低反应性和前肢肌力下降等(8.50±0.22,n=10)。与Ischemia组比较,HPC可明显缓解脑缺血小鼠的神经行为损伤(6.50±0.40,n=10,p<0.05)。然而,脑室内注射cPKCβⅡ抑制剂Go6983(5μl,8nM)后,则明显降低了HPC的神经保护作用(8.90±0.28,p<0.05 vs HPC+I,n=10)。　　 同样,HPC能明显降低Ischemia组小鼠脑组织的梗死体积(26.84±1.00％,p<0.05 vs36.25±1.34％,n=10)和水肿率(5.94±0.40％,p<0.05 vs11.17±0.54％,n=10)。应用cPKCβⅡ抑制剂Go6983后,阻断了HPC的保护作用并使梗死体积(36.25±1.34％,n=10)和水肿率(9.37±0.32％,n=10)明显增加。同时,Nissl结果显示,Ischemia和HPC+G06983组皮层神经细胞形态明显变化,细胞边缘不完整,部分破碎,而HPC+I组的细胞形态与假手术组类似,胞内着色较均匀；TUNEL染色检测凋亡神经细胞的结果发现,HPC(4.5±1.1％)可通过激活cPKCβⅡ(HPC+Go6983组:12.4±2.3％)明显减轻(p<0.05,每组n=3)缺血皮层半影区内凋亡神经细胞的百分比(Ischemia组:9.6±1.2％)。　　 此外,我们的在体和离体实验研究曾表明,重复性低氧明显增高cPKCβⅡ膜转位水平。本实验进一步证实,MCAO致脑缺血损伤可使皮层缺血核心区(61.6±5.6％)和半影区(59.7±15.1％)内cPKCβⅡ膜转位水平显著降低,而HPC则明显缓解(p<0.05,每组n=5)cPKCβⅡ膜转位水平在缺血核心区(134.0±18.7％)和半影区(101.0±18.1％)的下降。但缺血及HPC对cPKCβⅡ蛋白表达量的降低无显著影响(p>0.05,n=5)。　　 2.HPC小鼠脑组织内cPKCβⅡ相互作用蛋白的鉴定　　 为了进一步揭示参与低氧预适应保护缺血脑作用的cPKCβⅡ信号网络,本实验应用蛋白质组学技术对其相互作用的蛋白进行了鉴定。首先利用特异性cPKCβⅡ抗体分别对胞浆和膜相关蛋白组分进行免疫沉淀,然后对cPKCβⅡ免疫沉淀复合物进行双向电泳分离和MALDI-TOF-MS蛋白鉴定。结果共鉴定得到39个cPKCβⅡ相互作用蛋白,其中胞浆成分中15个,膜相关成分中为34个。应用PANTHER(Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships)蛋白分类系统即根据分子功能及参与的生理过程,对上述蛋白进行分类。结果表明,在两种蛋白组分中都存在热休克蛋白和细胞骨架相关蛋白如actin和tubulin等,而cPKCβⅡ发生膜转位后,则可与泛素蛋白连接酶、半胱氨酸蛋白酶、ATP合酶和G蛋白水解酶等发生作用。　　 双向电泳图谱分析结果提示,在胞浆成分和膜相关成分中分别有4和8个蛋白的表达量在预适应形成过程中发生了明显改变(超过1.5倍)。其中,胞浆成分中与cPKCβⅡ相互作用的乙酰CoA乙酰基转移酶1(Acat1)和半胱氨酸富集疏水结构域蛋白1(Chic1)预适应后明显下降；脑衰蛋白反应调节蛋白-2(CRMP-2)在胞浆成分中下降,而在膜相关成分中升高；与cPKCβⅡ相互作用的其它膜相关蛋白如低分子量神经丝蛋白(NF-L),14-3-3γ,泛素羧基末端水解异构酶1(UCHL1),谷氨酰胺合酶(GS),ATP合酶δ亚单位和NADH脱氢酶黄素蛋白2(Ndufv2)都明显升高。胞浆和膜相关成分中与cPKCβⅡ相互作用的α-烯醇化酶在预适应后都明显降低。　　 我们进一步应用逆向免疫沉淀验证TcPKCβⅡ与其中四个蛋白:CRMP-2,NF-L,14-3-3γ和UCHL1的相互作用,并利用Western blot验证了这些蛋白表达的变化情况。与上述双向电泳结果一致,即HPC形成后,胞浆组分中cPKCβⅡ相互作用的CRMP-2降低,而在膜相关组分中则增加；膜相关组分中cPKCβⅡ相作用的NF0L、14-3-3γ和UCHL1在HPC形成后明显增加。　　 3.cPKCβⅡ对缺血脑组织内CRMP-2蛋白水解和磷酸化水平的影响　　 CRMP-2为HPC脑组织内cPKCβⅡ相互作用蛋白之一,并有研究报道其参与神经元生长锥的塌陷和轴突生长。本实验检测了脑缺血皮层CRMP-2水解和磷酸化水平的变化情况,并发现MCAO脑缺血6h后,皮层缺血核心区内CRMP-27水解产物增加,而磷酸化水平降低。HPC可减轻缺血核心区CRMP-2蛋白水解及其磷酸化水平的降低,但cPKCβⅡ抑制剂预处理则取消了HPC的保护作用(p<0.05,n=4)。　　 总之,本研究发现cPKCβⅡ的激活介导了HPC对缺血脑组织的保护作用,并初步鉴定了参与脑HPC形成的cPKCβⅡ相互作用蛋白,其中cPKCβⅡ-CRMP-2信号通路可能参与了HPC对缺血脑组织的保护作用。研究成果进一步丰富了人们对脑I/HPC信号转导机制的认识,并为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供了实验依据,具有潜在的实用价值。