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第一章依达拉奉减轻缺氧复氧酸中毒诱导的神经元毒性损伤的作用及分子机制研究摘要目的：1研究依达拉奉对缺氧复氧酸中毒诱导的神经元毒性损伤的作用；2探讨依达拉奉对缺氧复酸中毒损伤的神经元保护的分子作用机制。方法：1建立缺氧缺糖复氧酸中毒(OGD-A/R)神经元损伤模型,为消除谷氨酸盐活性及电压依赖的Ca2+通道作用,所有操作中均加入了NMDA和AMPA受体阻滞剂和电压门控Ca2+通道拮抗剂；2分空白对照组、OGD-A/R组、OGD-A/R加不同浓度依达拉奉组、OGD-A/R加ASICs阻断剂组,检测不同时段LDH释放量、Caspase-3活性、Hoechst33258染色,并进行比较来评价依达拉奉对OGD-A/R损伤神经元的保护作用；3选择适当浓度的依达拉奉、ASIC1a阻滞剂及MEK/ERK阻滞剂分别对不同组别OGD-A/R模型培养中的细胞进行预处理,用Western-blot检测ERK、AKT及Bcl-2蛋白表达,RT-PCR检测BDNF、 Bcl-2mRNA表达,ELISIA检测BDNF蛋白表达,相应试剂盒或试剂检测LDH释放量(检测细胞损伤)及]Hoechst33258染色(观察细胞凋亡)。分析比较相应数据探讨依达拉奉在OGD-A/R模型中可能的保护机制。结果：1成功建立了OGD-A/R模型,并发现4h和8h即可出现LDH释放量爆发性增加。2ASICs阻滞剂PcTX和amiloride预处理后予OGD-A/R操作4h和8h LDH释放量显著减少。与ASICs阻滞剂相对应,依达拉奉预处理继以OGD-A/R操作可剂量依赖地减少损伤神经元LDH释放而产生与前者类似但更显著的保护作用。3与OGD-A/R组相比,依达拉奉预处理在各时点提高了BDNF和Bcl-2mRNA表达,且在OGD-A/R后8h作用最强；ELISIA检测提示依达拉奉在同一时间点使BDNF蛋白表达增多；Western-blot则显示在同一时间点依达拉奉在OGD-A/R后8h上调了Bcl-2蛋白表达；Caspase-3活性检测结果显示OGD-A/R极大地提高了Caspase-3活性,依达拉奉预处理可明显降低这种Caspase-3活性的升高,且具有剂量依赖性。这种保护作用与ASICs阻断剂使用后相当。4与正常对照组比较,OGD-A/R神经元p-AKT水平显著提高,而依达拉奉或PcTX预处理后OGD-A/R则显著抑制了AKT磷酸化。5与正常对照组相比,OGD-A/R组或OGD-A/R并PcTX预处理组可引起p-ERK1/2活性轻度升高,而依达拉奉干预OGD-A/R后则可引起p-ERK1/2活性明显升高。这种作用可被MEK/ERK阻断剂PD98059(10μM) and U0126(5μM)阻断；6OGD-A/R诱导细胞损伤引起核染色质断裂和LDH释放增多。而依达拉奉预处理可在很大程度上防止细胞核形态变化和减少LDH释放。然而MEK/ERK阻滞剂PD98059和U0126预处理几乎完全抵消了依达拉奉对OGD-A/R损伤神经元抗凋亡能力。结论：1本研究首次发现依达拉奉能减轻缺氧复氧酸中毒诱导的神经毒性损伤,且这一作用至少部分地依赖于ERK1/2的活性增强。2缺氧复氧酸中毒条件下,依达拉奉可通过上调BDNF及Bcl-2的表达、抑制caspase-3活性达到神经保护作用。3ASICs通道激活是缺氧复氧酸中毒诱导的细胞毒性损伤重要机制之一,依达拉奉对缺氧复氧酸中毒损伤神经元的保护作用可能与阻断ASICs有关。第二章依达拉奉减轻缺氧复氧诱导的神经元毒性损伤的分子机制研究摘要目的：1研究依达拉奉对缺氧复氧损伤神经元的保护作用；2探讨依达拉奉减轻缺氧复氧引起的细胞毒性损伤、保护神经元细胞的分子作用机制。方法：1建立缺氧缺糖复氧(OGD-R)神经元损伤模型；2分空白对照组、OGD-R组、OGD-R加不同浓度依达拉奉组,检测不同时段LDH释放量、Caspase-3活性、Hoechst33258染色(计算核固缩比例),并进行比较来评估依达拉奉对缺氧复氧损伤神经元的保护作用；3选择适当浓度的依达拉奉及依达拉奉并特异性AKT阻断剂LY294002和MK2206对细胞分别进行预处理后再行OGD-R处理,用Western-blot检测ERK、AKT及Bcl-2蛋白表达,RT-PCR检测BDNF、Bcl-2mRNA表达,ELISIA检测BDNF蛋白表达,相应试剂盒或试剂检测LDH释放量及Hoechst33258染色。分析比较相应数据探讨依达拉奉在OGD-R模型中可能的保护机制。结果：1成功建立了OGD-R模型,并发现在复氧后4h和8h即可出现明显的病理学改变。2依达拉奉预处理培养细胞减轻了缺氧复氧诱导的神经元损伤程度(LDH释放减少、Caspase-3活性和核固缩比例下降),且具有剂量依赖性。3确定LDH释放量检测可以作为一个简易可靠的衡量神经元损伤的定量指标,该结论经Caspase-3活性检测和Hoechst33258染色检测验证。4依达拉奉预处理后OGD-R, p-ERK的表达量没有明显变化,而p-AKT的表达量明显增加,差异有统计学意义,p<0.01。5依达拉奉预处理可明显降低OGD-R处理细胞中LDH释放和核固缩比例,p<0.01,但该过程可被MK2206抑制。6与OGD-R组比较,依达拉奉预处理显著上调了BDNF和Bcl-2mRNA的表达,且在OGD-R8h时尤其明显；ELISIA检测提示依达拉奉在同一时间点使BDNF蛋白表达增多；Western-blot则显示依达拉奉上调了Bcl-2蛋白表达,这种作用可被MK2206抑制。结论：1依达拉奉通过上调BDNF和Bcl-2的表达、抑制Caspase-3活性减轻缺氧复氧引起的神经元毒性损伤,即在发生缺氧复氧不合并酸中毒损伤条件下,依达拉奉已经具有神经保护作用。2PI3K/KT通路的激活可能是上述作用实现的重要途径之一。