好氧Zobellella sp.A63菌剂的制备及其强化红树林人工湿地脱氮效率的模拟研究

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本研究通过构建垂直流人工湿地小试系统,详尽研究了红树林湿地对海水养殖污水的净化效率。从特异性微生物强化脱氮的角度出发,对筛选到的一株耐盐好氧细菌Zobellella sp.A63(简写为A63)的硝酸盐还原能力进行了研究,得到了最佳脱氮条件;利用风车草生物炭吸附和PVA微球包埋固定的方法制备特异性A63菌剂,通过对比研究了不同形式A63菌剂强化低碳氮比(C/N=2)和高碳氮比(C/N=6)海水养殖污水的脱氮效果,确定了特异性微生物强化人工湿地脱氮的可行性;利用高通量测序的方法分析了高低碳氮比条件下不同菌剂的添加对湿地系统脱氮效率及微生物群落结构和功能的影响,最终确定了不同碳氮比条件下的脱氮机制和途径,提高了人工湿地对含盐污水的脱氮效率。主要结论如下:(1)菌株A63生长条件广,脱氮效率高。其在盐度0-10.0%,pH值5.0-10.0,温度20.0-40.0℃范围内均能生长,最适反硝化碳源为柠檬酸钠,以乙酸钠为碳源时,最适盐度为3.0%(以NaCl计),最适C/N为10.0,最适pH为7.5,最适温度为33.0℃。在以乙酸钠为碳源的最优条件下,菌株A63在12h内基本能把208.8mg/L的NO3--N去除完全,脱氮率高达99%以上,在含盐废水的生物脱氮中具有巨大的应用价值。(2)在菌剂添加前(第一阶段,C/N为2),人工湿地小试系统对养殖污水NH4+-N的去除率高达80%,但NO3--N去除率却低至40%,导致TN去除率也仅有50%左右,这主要是因为盐度抑制了反硝化细菌的活性,同时有机氮源的不足也进一步限制了反硝化作用的发生而无法完成NO3--N的去除。当A63菌剂添加后(第二阶段,C/N为2),各系统NH4+-N去除率仍保持在81.5%左右,菌剂的添加对NH4+-N的最终去除率并不存在显著差异(p=0.833)。而对NO3--N和TN而言,CW2(投加游离A63菌剂)、CW3(投加生物炭吸附A63菌剂)和CW4(投加PVA微球包埋A63菌剂)系统的去除率分别较对照组CW1提高了约10%、20%、10%和5%、10%、5%。这说明菌剂A63的投加在一定程度上能提高了红树人工湿地处理低碳氮比海水养殖污水的脱氮效率,尤其是生物炭吸附固定化A63菌剂添加湿地系统(CW3)。(3)当C/N进一步提高到6后(第三阶段),各系统对NH4+-N的去除率也进一步提高到96.7%。同样,各系统NO3--N和TN的去除率也都较C/N为2时有显著提高,CW1组NO3--N和TN的去除率分别提高到86%和87%左右,而菌剂添加组NO3--N和TN的去除率则进一步提高到99%和97%,较对照组CW1分别提高了约10%,且CW1、CW2与CW3之间不再存在显著差别,这说明菌剂A63的添加在湿地系统中形成了富集,改善了菌群结构,强化了NO3--N和TN的去除。仅就TN去除率而言,第三阶段的TN去除率较第一阶段(C/N为2)提高了 50%左右,较第二阶段(添加菌剂,C/N为2)提高了 20%左右,这说明了投加高效好氧反硝化菌剂和补充碳源都能显著改善湿地系统微生物群落结构,定向富集高效脱氮功能微生物,是强化人工湿地处理含盐污水脱氮效率的一种可行方法。(4)高通量测序和生物信息学分析表明,菌剂A63添加后(C/N为2)CW3系统的微生物多样性最高,其次是CW4系统,CW1和CW2最低;当C/N提高6后,CW1多样性最高,其次为CW3和CW4,CW2最低,这说明在不同C/N条件下,不同菌剂的投加对系统微生物的群落结构有显著影响。各系统脱氮微生物主要是自养硝化细菌、好氧反硝化细菌和硫自养反硝化细菌,优势种群为变形菌门(Proteobacteria),相对含量高达55.3%-69.7。在C/N为2条件下,外加卓贝尔氏(zobellella)A63菌剂在CW2和CW4系统的上层形成了富集,丰度高达22.5%和16.6%,强化了反硝化脱氮;而CW3系统A63丰度仅为2.7%,与对照组CW1丰度(2.4%)基本一致,总好氧反硝化细菌丰度也仅为27.8%,远低于CW1(50.2%)、CW2(55%)和CW4(38.3%),但CW3系统却有最佳的脱氮效率,这主要是因为其还含有丰富的硫自养反硝化细菌,能在系统下层低C/N和低溶解氧的情况下发挥高效的脱氮作用。随着碳氮比进一步提高,各系统硫自氧反硝化细菌丰度虽有所下降,但好氧反硝化细菌丰度却提高到34.9%-70.2%,脱氮效率也进一步提升。此外,各系统的好氧反硝化细菌丰度从系统上层到下层丰度降低,而硫氧化还原细菌的丰度却逐渐上升,这也预示着系统中上层和下层可能存在着完全不同的脱氮途径。(5)无论在高低碳氮比条件下,各系统硝化细菌的丰度都较低,但各系统在C/N为2时都具有80%以上的氨氮去除率;C/N提高到6后,氨氮去除率进一步提高到96.7%以上,说明AOA和AOB的氨氧化能力仍然有效的发挥了作用。进一步的宏基因组分析表明湿地系统内存在丰度较低的氨单加氧酶基因amoCAB和羟基脱氢酶基因Hao,且未检测到亚硝酸盐氧化酶基因NxrAB,这表明NOB受到了进水盐度的显著抑制,AOA和AOB驱动的短程硝化可能是湿地系统铵态氮氧化的主要途径。(6)好氧反硝化菌剂的添加和海水养殖污水的长期驯化促使自养硝化细菌、好氧反硝化细菌、硫氧化和还原细菌成为湿地系统内的优势脱氮菌群。本研究构建的垂直流人工湿地小试系统在处理低碳氮比(C/N为2)养殖污水时的脱氮途径可分为两类:在有机物和溶解氧浓度较高的中上层主要以自养硝化-好氧反硝化脱氮途径为主,硫自氧反硝化和厌氧反硝化为辅的多种脱氮过程;在有机物和溶解氧浓度较低的下层主要以硫自氧反硝化脱氮途径为主,好氧反硝化、厌氧反硝化和厌氧氨氧化为辅的多种脱氮途径。在处理高碳氮比(C/N为6)养殖污水时,脱氮途径则以短程硝化-好氧反硝化为主,硫自氧反硝化、厌氧反硝化和厌氧氨氧化为辅的多种脱氮途径。而无论高低C/N条件下,A63的添加与富集都强化了湿地系统好氧反硝化作用,提升了脱氮效率。
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