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杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种极其耐盐的单细胞真核生物,是研究植物高盐适应的模式生物。促有丝分裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,在真核生物中广泛存在。大量研究表明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶广泛地参与了植物对干旱、盐胁迫等逆境胁迫的应答反应。深入探讨MAPK的作用机制,对于阐明盐藻耐盐的分子机制及应答盐胁迫信号的分子途径具有重要的科学意义。本研究采用免疫共沉淀和酵母双杂交等技术筛选盐藻DsMAPK(GenBank:JQ782412)的相互作用蛋白质,取得如下成果:1.将含有原核表达载体pGS21a-DsMAPK的E.coli BL21表达菌株,经IPTG诱导使MAPK基因在E.coli BL21中成功表达。将可溶性蛋白经过His柱纯化获得了高纯度的融合蛋白,用该融合蛋白作为抗原免疫动物,制备了多克隆抗体,经ELISA检测抗血清纯化抗体效价≥512K。以内源性靶蛋白为诱饵,将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育,用蛋白A/G琼脂糖珠纯化复合物,经western检测后经质谱分析,检测到与DsMAPK相互作用的蛋白质共165种。通过GO和KEGG分析,发现这些差异蛋白主要参与了新陈代谢、遗传信息的传递以及信号转导等生物学调控过程。蛋白质互作网络分析发现,直接与DsMAPK相互作用的蛋白质有4种。2.利用实时荧光定量PCR技术检测DsMAPK互作蛋白基因的表达情况。采用LiAc/PEG介导法将反义表达载体pMDCaMGN-Cat质粒导入盐藻细胞。通过氯霉素筛选获得转基因盐藻,用qRT-PCR的方法分析盐胁迫1 h转基因盐藻的DsGAPDH,DsRbcS,DsPKC,DsPGK1表达水平的变化情况,结果显示结果显示转基因盐藻经高盐胁迫1 h后DsMAPK表达量比野生型盐藻有明显降低,差异达到显著水平(P<0.05),证明反义基因的导入有效抑制了DsMAPK的表达。转基因盐藻DsPKC、DsGAPDH表达量比野生型盐藻有明显降低,差异达到显著水平(P<0.05)。同时,DsRbcS、DsPGK1及DsGPDH的表达量均有不同程度的降低,说明这些基因的表达与DsMAPK存在一定的相关性。3.利用DNA重组技术将DsPKC、DsMAPK基因的开放阅读框分别克隆到酵母表达载体pGBKT7、pGADT7上,经测序验证读码框正确,证明成功构建了盐藻DsPKC和DsMAPK的酵母表达载体;将酵母表达质粒pGBKT7-DsPKC、pGADT7-DsMAPK转化Y2H Gold感受态细胞,经菌落PCR鉴定质粒成功转入酵母菌Y2H Gold。将pGBKT7-DsPKC/Y2H Gold菌液涂布SD/-Trp平板、pGADT7-DsMAPK/Y2H Gold菌液涂布SD/-Leu平板,结果表明,含有酵母表达载体的酵母菌株和含有空载体的酵母菌,在相同的培养时间内菌株大小相同,生长状态一致,证明该蛋白没有毒性。将成功转入酵母菌Y2H Gold的菌落转涂在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培养基上进行自激活检测,结果表明,这两种蛋白均不具有自激活性。将pGBKT7-DsPKC、pGADT7-DsMAPK共转化Y2H Gold感受态细胞,共转化产物直接涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal营养缺陷型固体培养基,在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal固体培养基上,实验组(pGADT7-DsMAPK+pGBKT7-DsPKC)有生长且变蓝,说明DsMAPK与DsPKC存在相互作用。该研究成果为在蛋白质水平上阐明盐藻DsMAPK的功能提供了参考,为我们深入研究杜氏盐藻响应盐胁迫的分子机制提供了新的信息。