目的:卵巢早衰（POF）是指女性40岁前,由于卵巢内卵泡耗竭而发生的卵巢功能衰竭,临床表现为原发性或继发性闭经,同时伴有围绝经期症状。卵巢作为雌性哺乳动物的生殖器官,具有产生成熟卵泡、分泌雌激素等功能,卵泡是其基本的结构与功能单位,由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞组成。卵泡发育主要由原始卵泡开始,经历初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡最终发育成熟并排卵。卵泡由原始卵泡发育至次级卵泡的阶段称为腔前或非促性腺激素依赖阶段,该阶段主要依靠生殖细胞相关转录因子发挥重要的调控作用,例如FIGLA、SOHLH1、LHX8等均参与调控腔前卵泡的发育过程。LHX8作为生殖细胞发育相关转录因子,是LIM同源框转录因子家族的一员,LIM结构域由两个特殊的锌指构成,位于同源结构域的N端,使LIM-HD蛋白能够以同分或异分的方式与其他转录因子相互作用。文献报道Lhx8-/-雌鼠卵巢内无原始卵泡,原始卵泡组装发生异常,卵母细胞无法生长,出生后生殖细胞缺失,成年后卵巢萎缩,大量生殖细胞特异性基因表达紊乱,出现生殖功能障碍。生殖细胞的发育是一个连续的过程,在卵泡的不同发育阶段,相同的转录因子能够发挥不同的调控作用,广泛性敲除实验只能探究转录因子LHX8在原始卵泡组装过程中作用,LHX8表达贯穿于卵泡发育的各个阶段,在后续卵泡发育过程中作用机制尚未有文献报道。Zp1、Zp2、Zp3是小鼠透明带基因家族成员,Zp1、Zp2、Zp3通过编码翻译形成透明带蛋白,对卵母细胞的发育、受精及着床具有非常重要的作用。文献报道在卵泡发育的早期阶段,FIGLA能够直接转录调控Zp1、Zp2、Zp3基因的表达,SOHLH1能够转录调控Zp1、Zp3基因的表达,间接调控Zp2基因的表达。在初级卵泡阶段,SOHLH1蛋白逐渐消失,ZP1、ZP2、ZP3蛋白在初级卵泡中大量表达直至排卵前。文献报道对Lhx8广泛性敲除新生雌鼠芯片结果分析,得出Zp2、Zp3等卵母细胞发育关键基因均出现表达差异,Zp1基因表达无显著差异,在初级卵泡中进行验证后,推测LHX8可能直接或间接调控Zp2、Zp3的表达。通过生物信息学预测发现Zp3基因启动子序列存在LHX8转录结合位点,因此推测LHX8可能直接调控Zp3基因的表达。本研究通过体外分离培养初级卵泡,运用显微注射siRNA的方法,通过形态学观察以及分子生物学实验初步探究转录因子LHX8对初级卵泡发育的影响以及对Zp3基因表达的调控。研究方法:本研究通过构建Lhx8-pcDNA3.0真核表达质粒,验证Lhx8-siRNA干扰效率;通过对比空白对照组、阴性对照组、显微注射Lhx8-siRNA组体外培养初级卵泡,观察卵泡由初级发育至次级的形态学变化及时间点变化;通过q RT-PCR实验、Western blot实验检测Lhx8基因沉默前后初级卵泡发育相关基因m RNA及蛋白的表达水平;构建Zp3启动子荧光素酶表达质粒和LHX8真核表达质粒并利用荧光素酶活性测定实验检测荧光值,通过Ch IP实验检测LHX8在Zp3基因启动子序列上的结合情况并筛选主要结合位点。结果:1、成功构建Lhx8-pcDNA3.0真核表达质粒,通过与Lhx8-siRNA共转染HEK293T细胞,获得Lhx8-mus-972干扰效率最高,抑制率为95.3%。2、qRT-PCR实验和Western blot实验表明Lhx8基因沉默后Lhx8 m RNA和蛋白表达量均下降,说明显微注射Lhx8-siRNA可以有效使初级卵泡中Lhx8基因沉默。3、通过体外培养初级卵泡,阴性对照组与空白对照组相比表明:显微注射操作未对初级卵泡生长及发育造成影响,两组均2d开始逐渐发育,经历5d发育为次级卵泡;注射Lhx8-siRNA组与阴性对照组相比:Lhx8基因沉默后,初级卵泡发育较为缓慢甚至出现暂时停滞,颗粒细胞增殖受阻,显微注射后6d开始恢复发育,7d可发育为次级卵泡。4、qRT-PCR和Western blot实验结果显示,在初级卵泡中,Lhx8基因沉默后,Zp2、Zp3m RNA表达量显著下调,ZP2、ZP3蛋白表达量显著下调。5、共转染LHX8真核表达质粒和Zp3启动子区域荧光素酶质粒的实验组荧光素酶活性高于对照组,Ch IP实验结果显示转录因子LHX8可以结合于Zp3转录起始位点上游（-1663bp,-1556bp）、（-1305bp,-1298bp）、（-1256bp,-1251bp）、（-1047bp,-1040bp）的结构域,与（-1305bp,-1298bp）（CTAATTAA）位点结合作用最强。结论:1、Lhx8是卵泡由初级发育至次级的关键基因。2、转录因子LHX8可直接激活Zp3的转录,（-1305bp,-1298bp）（CTAATTAA）为主要特异性结合位点。