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深海海洋中有着丰富的微生物资源,尤其是深海真菌,能够产生大量新颖的、有较强生物学活性的次级代谢产物。由于独特的海洋生存环境,例如高温,高压,低营养以及弱光照,导致海洋真菌具有丰富的物种多样性,加上特殊的防御机制,能促进各种类型的次级代谢产物的生物合成。此外,已经报道过的新型海洋真菌次级代谢产物高达有1000多种,而且部分在抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、抗氧化以及抗癌症等方面有较强的活性。胶霉毒素是烟曲霉合成的具有氧化还原性的非核糖体环肽,是一种含2个硫的有很强致病性的二酮哌嗪类化合物(ETPs)。胶霉毒素能破坏细胞内氧化还原平衡,产生活性氧等有害物质。其在抗肿瘤、抗真菌、抗氧化以及作为医疗诊断试剂方面具有良好的开发前景。本课题组前期已从深海真菌Geosmithia pallida FS140中分离出了大量具有抗真菌及抗肿瘤活性的胶霉毒素及其衍生物,其中有大量结构新颖的胶霉毒素类二聚体化合物,提示该真菌可能存在独特的胶霉毒素生物合成基因簇。本论文对分离自南海深海沉积物的真菌曲霉Geosmithia pallida FS140中胶霉毒素生物合成关键基因gliT和gliM2进行了异源表达纯化和酶学性质分析,硫氧还蛋白还原酶的最适酶促反应温度40℃,最佳酶促反应pH为pH7.0,热稳定性在30℃时最好;甲基转移酶的最适反应温度为35℃,最佳酶促反应pH为pH7.0,热稳定性在35℃时最好,为后续其在生产实践中应用奠定了基础。对gliF基因进行了在酵母细胞中的成功克隆,构建了含gliF基因的pPIC9k表达载体,并对其进行了成功的表达纯化,为后续继续研究其酶学性质提供了有力条件。并且对功能基因gliT和gliF进行了CRISPR-Cas9系统的构建,优化了深海真菌原生质体的制备方法和转化方法,为后续深海真菌Geosmithia pallida FS140胶霉毒素生物合成功能基因和代谢通路的研究奠定了分子生物学基础。综上所述,本研究从深海真菌中筛选出胶霉毒素生物合成关键基因gliT、gliM2和gliF,并对其进行了体外克隆、异源表达、分离纯化与酶活分析,为进一步研究深海真菌Geosmithia pallida FS140的硫氧还蛋白还原酶、氧甲基转移酶和细胞色素氧化酶的生物学功能及更好地将深海真菌Geosmithia pallida FS140应用于工业生产提供参考依据。并且,构建出适用于深海丝状真菌的CRISPR-Cas9敲除系统和原生质体制备系统,为深海丝状真菌更多功能基因的挖掘以及分离新型活性次级代谢产物骨架奠定分子生物学基础。