玉米大斑病是由大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）引起的病害,是玉米最具破坏性的叶部病害之一,主要危害玉米的叶片、叶鞘。该病原真菌以半活体营养方法侵染宿主组织,在活体营养生长期间分泌效应物,抑制或调节宿主防御反应以逃避宿主检测,从而在宿主组织中定殖,最终宿主细胞因毒素或降解酶的分泌而被杀死。本课题组前期通过对玉米大斑病菌CFEM（Common in several Fungal Extracellular Membrane proteins）家族中的效应蛋白进行生物信息学手段的预测和功能分析,获得一个可以抑制INF1诱导的植物细胞坏死的效应蛋白StCFEM12,并进一步利用酵母双杂交文库筛选获得其在玉米中的互作蛋白ZmFd1。本研究对StCFEM12及其靶标蛋白基因进行了表达模式及亚细胞定位分析,验证效应蛋白StCFEM12以玉米铁氧还蛋白为作用靶标,并进一步创制了StCFEM12过表达突变体,深入研究病菌侵染宿主过程中StCFEM12基因的功能。主要结果如下:1.基于PEG介导的原生质体转化技术,经筛选和验证获得了 2株StCFEM12过表达突变体,分别命名为StCFEM12-OE1、StCFEM12-OE2。2.StCFEM12基因过表达突变体表型分析。StCFEM12基因的过表达对病菌的菌丝生长及分生孢子、附着胞发育没有明显影响,但导致致病力的显著增强。3.StCFEM12蛋白在病菌内的定位分析。显微观察发现,病菌气生菌丝体和分生孢子的细胞外表面呈现强烈且明亮的荧光,细胞质内呈现较弱荧光,而菌丝及分生孢子隔膜处无荧光现象。表明该蛋白定位于病菌外表面,在细胞质内合成,逐渐被运输到细胞膜而后被分泌出去。4.StCFEM12蛋白在玉米原生质体内的分析。镜检发现,玉米叶肉细胞原生质体的叶绿体与胞内绿色荧光区域完全重合,而细胞膜及胞质中其他区域未检测到荧光信号。推测StCFEM12靶向玉米叶片叶绿体。5.利用BiFC技术证实StCFEM12和靶标ZmFd1存在互作关系。6.分析StCFEM12与ZmFd1在植物细胞中的亚细胞定位,结果表明,StCFEM12与ZmFd1在植物细胞中具有相同的亚细胞定位,且StCFEM12与叶绿体Marker蛋白ZmRbc1也具有一致的亚细胞定位,说明StCFEM12与ZmFd1均定位于叶绿体,该结果与生物信息学预测结果一致。7.检测玉米大斑病菌效应蛋白StCFEM12及其靶标蛋白ZmFd1的表达模式发现,大斑菌侵染玉米叶片过程中,包括侵染点和营养型转变两个关键时期,效应蛋白StCFEM12的基因表达呈持续上升趋势,同时,ZmFd1及其下游互作蛋白ZmFTR1亦表现表达水平上调,三者具有一致的表达水平变化趋势。初步断定该效应蛋白在侵染早期具有促进病菌致病的能力以及在病菌形态转变过程中起到一定调节作用。8.利用酵母双杂交技术和酵母三杂交技术明确了 StCFEM12与ZmFd1的互作关系强于ZmFTR1,证明StCFEM12与ZmFTR1竞争结合ZmFd1的。9.分别测定接种野生型和突变体的玉米叶片中光合电子传递速率以及叶绿素含量,结果发现效应蛋白的过量表达导致光合电子传递速率和叶绿素含量的明显降低,推测该效应蛋白通过靶向竞争结合铁氧还蛋白破坏宿主叶绿体功能。本研究明确了玉米大斑病菌效应蛋白StCFEM12是病菌的重要致病因子,以玉米叶绿体定位的铁氧还蛋白ZmFd1为作用靶标,通过与ZmFTR1竞争结合ZmFd1,影响光合电子传递,抑制寄主叶绿体功能,以促进自身侵染,初步揭示了植物病原真菌CFEM效应蛋白的毒性作用机制,为相关抗病育种及防控新策略的研发提供了理论依据。