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生长抑制因子(Somatostatin,ss)是脊椎动物(包括人)机体中具有多种生理功能的神经激素。研究SS基因工程疫苗既具有理论意义,又有广泛的应用前景。 本研究内容主要包括: 1、S14基因的人工合成:根据S14基因序列,设计一对引物,经肽链延伸反应后,克隆到pBluescript载体的SacII与XhoI位点,连接产物转化大肠杆菌JU109细胞,在LBA+平板上长出重组子,挑取单个菌落扩大培养,抽提质粒DNA进行PCR扩增,重组质粒测序。结果表明,合成的S14含其上游的酵母信号肽因子及下游的SacII位点,共计73bp,包含24个氨基酸,S14基因的序列与实验设计完全一致。 2、乙肝表面抗原(HBsAg)基因的PCR扩增与克隆:设计一对引物,从PHBV质粒经PCR扩增,再克隆到pBluescript载体,连接产物转化到JM109细胞,用快速酚法初筛质粒,重组质粒测序,结果显示扩增的HBsAg共计590bp,包含190个氨基酸,已获得完全正确的DNA片段。 3、S14基因与HBsAg基因的融合:将pBluescript S14和pBluescriptHBsAg质粒分别经SacII和XhoI及SacII和SacI酶切,得到的S14基因和HBsAg基因在T4DNA连接酶作用下进行连接,获得S14基因与HBsAg基因融合片段的重组子pBluescriptS14/HBsAg,再转化JM109细胞, 四川大学博士学位论文 进行重组子筛选。经Sacll和Saclk切电泳可见约600hp的DNA带,与 HBsAg基因大小相当;用Xhol 和Sacl$ 切电泳可见约700hp 的DNA带, 同S…与HBsAg基因融合片段的大小相等.说明S;。与HBsAg基因在 pBIUescUIPt #体中得到了正确融合。测序结果表明,PCR产物657hp。 4、S../HBs^gi合茧因的亚克医:将pBluescript S;。/HBsAg质粒与 pPICZaA载体分别经Xhol和XbalN切,再在T4DNA连接酶作用下进行连 接,获得工程菌表达型 PPICZaA S;/HBSAg质粒,转化大肠杆菌 T0P10细胞, 经Xhol和Xbal与Sacll和Xbal酶切电泳,证实S;。/HBsAg融合片段克隆 到了gPICZaA载体。序列测定结果表明,S14/HBsAs融合基因的序列与实 验设计完全一致。 5、酵母工程茵的构建与表达:PPICZaA S;。/HBsAg质粒经Sacl酶切线 性化后,用电击转化法和化学转化法转人巴斯德毕赤酵母表达菌株X33。 选取单个菌落分别点种到删平板和MD平板,找出在回D上生长正常,W 上生长缓慢或不生长的菌落,即阳性菌落,再以阳性菌落分别涂布Zeocine 含量 500ug加,1000ug砌L的 YPD平板,以高浓度的抗生素筛选高拷贝的 酵母工程菌,在含 500ug/mL高浓度抗生素平板上获得了 15个转化子,取 其中5个进行PCR扩增,有3个扩增产物与阳性对照相同,说明此酵母细 胞中已含有S*/HBSAg融合片段,其中之一命名为P.p8St。TISX-33/ S:.川BSAg,在 0.5$甲醇诱导下进行分泌型表达。$达产物经 SDS-PAGE检 测表明,转化于表达了S:丫HBSAg M合蛋白,蛋白分子tie为22KD,Western blot分析表明,表达蛋白具有较好的抗原性和特异性。 6、动物试验:将重组矗因工程苗苗诱导表达波免疫家兔,然后每周采 血分离血清测邑钻抗体,结果在免疫后2周,血渝中检出SS抗体;兔疫 注射10日龄小白鼠,每5天称重一次,结果表明:注射诱导表达液的试验 组比对照组槽重差异显著叩<0.05人5周后用HBsAg ELISA检测试验盒 3 四川大学博士学位论文 对试验组小鼠抽血检查,结果为阳性。对照组为阴性。 以上试验结果表明,本试验首次成功地在 P.pastori s系统实砚了 S;/HBSAg融合蛋白的高效表达,为进一步工业化大量生产及其在临床医学 与畜牧业生产中的应用打下了坚实基础。