生长抑制因子（Somatostatin，ss）是脊椎动物（包括人）机体中具有多种生理功能的神经激素。研究SS基因工程疫苗既具有理论意义，又有广泛的应用前景。 本研究内容主要包括： 1、S₁₄基因的人工合成：根据S₁₄基因序列，设计一对引物，经肽链延伸反应后，克隆到pBluescript载体的SacII与XhoI位点，连接产物转化大肠杆菌JU109细胞，在LBA⁺平板上长出重组子，挑取单个菌落扩大培养，抽提质粒DNA进行PCR扩增，重组质粒测序。结果表明，合成的S14含其上游的酵母信号肽因子及下游的SacII位点，共计73bp，包含24个氨基酸，S14基因的序列与实验设计完全一致。 2、乙肝表面抗原（HBsAg）基因的PCR扩增与克隆：设计一对引物，从PHBV质粒经PCR扩增，再克隆到pBluescript载体，连接产物转化到JM109细胞，用快速酚法初筛质粒，重组质粒测序，结果显示扩增的HBsAg共计590bp，包含190个氨基酸，已获得完全正确的DNA片段。 3、S₁₄基因与HBsAg基因的融合：将pBluescript S₁₄和pBluescriptHBsAg质粒分别经SacII和XhoI及SacII和SacI酶切，得到的S₁₄基因和HBsAg基因在T4DNA连接酶作用下进行连接，获得S₁₄基因与HBsAg基因融合片段的重组子pBluescriptS₁₄/HBsAg，再转化JM109细胞， 四川大学博士学位论文 进行重组子筛选。经Sacll和Saclk切电泳可见约600hp的DNA带，与 HBsAg基因大小相当；用Xhol 和Sacl＄ 切电泳可见约700hp 的DNA带， 同S…与HBsAg基因融合片段的大小相等．说明S；。与HBsAg基因在 pBIUescUIPt ＃体中得到了正确融合。测序结果表明，PCR产物657hp。 4、S．．／HBs＾gi合茧因的亚克医：将pBluescript S；。／HBsAg质粒与 pPICZaA载体分别经Xhol和XbalN切，再在T4DNA连接酶作用下进行连 接，获得工程菌表达型 PPICZaA S；／HBSAg质粒，转化大肠杆菌 T0P10细胞， 经Xhol和Xbal与Sacll和Xbal酶切电泳，证实S；。／HBsAg融合片段克隆 到了gPICZaA载体。序列测定结果表明，S14／HBsAs融合基因的序列与实 验设计完全一致。 5、酵母工程茵的构建与表达：PPICZaA S；。／HBsAg质粒经Sacl酶切线 性化后，用电击转化法和化学转化法转人巴斯德毕赤酵母表达菌株X33。 选取单个菌落分别点种到删平板和MD平板，找出在回D上生长正常，W 上生长缓慢或不生长的菌落，即阳性菌落，再以阳性菌落分别涂布Zeocine 含量 500ug加，1000ug砌L的 YPD平板，以高浓度的抗生素筛选高拷贝的 酵母工程菌，在含 500ug／mL高浓度抗生素平板上获得了 15个转化子，取 其中5个进行PCR扩增，有3个扩增产物与阳性对照相同，说明此酵母细 胞中已含有S＊／HBSAg融合片段，其中之一命名为P．p8St。TISX－33／ S：．川BSAg，在 0．5＄甲醇诱导下进行分泌型表达。＄达产物经 SDS－PAGE检 测表明，转化于表达了S：丫HBSAg M合蛋白，蛋白分子tie为22KD，Western blot分析表明，表达蛋白具有较好的抗原性和特异性。 6、动物试验：将重组矗因工程苗苗诱导表达波免疫家兔，然后每周采 血分离血清测邑钻抗体，结果在免疫后2周，血渝中检出SS抗体；兔疫 注射10日龄小白鼠，每5天称重一次，结果表明：注射诱导表达液的试验 组比对照组槽重差异显著叩＜0．05人5周后用HBsAg ELISA检测试验盒 3 四川大学博士学位论文 对试验组小鼠抽血检查，结果为阳性。对照组为阴性。 以上试验结果表明，本试验首次成功地在 P．pastori s系统实砚了 S；／HBSAg融合蛋白的高效表达，为进一步工业化大量生产及其在临床医学 与畜牧业生产中的应用打下了坚实基础。