【摘 要】
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鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)引起的小鹅瘟,主要感染雏鹅和雏番鸭,发病率和致死率高,给我国乃至世界的水禽养殖业都带来了巨大的经济损失。目前关于GPV的致病机制仍不清晰。课题组通过前期实验发现GPV NS1蛋白可以通过线粒体途径诱导鹅胚成纤维细胞(GEF细胞)凋亡,但具体机制尚未阐明。因此本研究拟从与NS1蛋白具有互作关系的线粒体外膜蛋白VDAC1入手,通过上调或下调表达VD
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鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)引起的小鹅瘟,主要感染雏鹅和雏番鸭,发病率和致死率高,给我国乃至世界的水禽养殖业都带来了巨大的经济损失。目前关于GPV的致病机制仍不清晰。课题组通过前期实验发现GPV NS1蛋白可以通过线粒体途径诱导鹅胚成纤维细胞(GEF细胞)凋亡,但具体机制尚未阐明。因此本研究拟从与NS1蛋白具有互作关系的线粒体外膜蛋白VDAC1入手,通过上调或下调表达VDAC1蛋白来检测GEF细胞凋亡的相关变化,进而探究NS1诱导宿主细胞凋亡的机制。1.首先利用生物信息学方法对NS1蛋白进行了生物学特性分析,明确了NS1蛋白为酸性、非稳定性亲水蛋白质,且不含信号肽序列和跨膜区。进行了亚细胞定位预测,发现NS1蛋白在细胞核和线粒体中均有定位,与前期实验结果相符。随后克隆线粒体膜上可能参与凋亡的相关基因,并构建其表达载体,通过免疫共沉淀和GST-pull down实验验证与NS1蛋白的互作,结果表明NS1蛋白在线粒体膜上的互作蛋白为VDAC1蛋白。2.设计多条小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA),利用RT-qPCR和Western blot筛选出最佳的siRNA,通过RNA干扰方法构建了VDAC1在GEF细胞中的沉默表达体系。另外,将VDAC1的真核表达载体转染至GEF细胞中,从而构建成VDAC1的过表达体系。将NS1分别转染至GEF的VDAC1沉默表达体系和过表达体系中,利用流式细胞术检测细胞凋亡的变化。结果发现,沉默表达VDAC1体系中NS1诱导细胞凋亡的能力减弱,而过表达VDAC1可以增加NS1诱导的细胞凋亡。接下来,通过Western blot对凋亡标志性蛋白caspase家族进行检测。结果发现,VDAC1的增加可以影响NS1诱导caspase3和caspase 9的活性,而caspase 9被激活正是线粒体凋亡途径的标志性因子。同时,本研究又将GPV分别感染两个体系,得出的凋亡变化结果与NS1转染的结果相一致。从而证明了VDAC1是参与NS1通过线粒体途径诱导宿主细胞凋亡的关键蛋白。但TCID50实验表明VDAC1并不直接参与GPV的复制。综上,本研究初步阐明了NS1蛋白通过线粒体途径诱导细胞凋亡的机制,NS1首先与线粒体外膜蛋白VDAC1结合形成复合物,随后导致线粒体膜通透性发生改变,使线粒体损伤,进而激活了caspase 3和caspase 9,导致细胞发生凋亡。本研究为进一步阐明GPV的复制过程及致病机制提供了参考。
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