目的探讨内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)的培养及鉴定,比较密度梯度离心和全骨髓培养法分离培养EPCs的差异。方法取4周雄性近交系C57BL／6J小鼠骨髓,分别采用密度梯度离心及全骨髓培养法进行培养。相差倒置显微镜观察各组细胞贴壁情况和细胞形态；采用免疫荧光检测细胞摄取Dil-acLDL及结合FITC-UEA-I能力；采用免疫荧光检测细胞血管性血友病因子(vWF)表达,免疫细胞化学检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达及流式细胞术检测细胞表面标志CD34、CD133和Flk-1的表达。结果(1)全骨髓培养法培养贴壁细胞多数呈长梭形铺展生长,部分细胞呈类圆形及纺锤形；密度梯度离心培养细胞多呈类圆形、纺缍形、梭形或多边形,部分细胞呈线状排列,培养过程中可见典型铺路石样外观及形成血管样结构。(2)密度梯度离心培养摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-I双阳性率较全骨髓培养法高[(95.3±1.8)%Vs.(59.7±8.6)%,P<0.05]。(3)密度梯度离心培养细胞vWF及eNOS表达阳性率均高于全骨髓培养法[(92.9±1.5)%vs.(51.6±3.5)%,(90.3±1.5)%vs.(45.8±1.6)%,均P<0.05]。(4)密度梯度离心培养细胞CD34+Flk-1+、CD34+CD133+Flk-1+细胞百分比均高于全骨髓培养法[(26.09±1.62)%vs.(7.58±0.70)%,(18.41±0.97)%vs.(5.00±0.19)％,均P<0.05],CD34+CD133+细胞百分比低于全骨髓培养法[(49.51±1.79)%vs.(72.68±5.30)%,P<0.05]。(5)随着培养时间延长,密度梯度离心CD34+CD133+、CD34+Flk-1+、CD34+CD133+Flk-1+细胞百分比逐渐增高,至第14 d已分别达(45.34±2.12)%、(11.65±1.01)%及(9.513±0.87)%。结论(1)密度梯度离心及全骨髓培养法在EGM-2MV培养体系下均可培养出EPCs。(2)密度梯度离心较全骨髓培养法培养的EPCs纯度高。目的探讨单纯烟雾暴露所致慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)小鼠模型建立及病理学、气道炎症、肺功能评价及全身表现。方法16只C57BL／6J小鼠随机分为正常对照组及COPD组,每组8只,采用自制烟雾暴露箱进行香烟烟雾暴露,6支／次,4次／d,连续90 d,定期检测体重。烟雾暴露90 d并观察30 d后处理两组小鼠,收集标本。PLY3211小动物肺功能检测系统行小鼠肺功能检查；采用静脉留置针行灌洗术并留取支气管肺泡灌洗液(BALF)行细胞计数及分类计数；肺组织病理切片苏木素-伊红(HE)染色后观察形态学改变并定量测定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI)；终点比色法检测血清总抗氧化能力(T-AOC);骨骼肌组织病理切片苏木素-伊红(HE)染色后观察形态学改变并采用TUNEL法检测骨骼肌凋亡率。结果(1)与正常对照组比较,COPD组小鼠气道阻力(Raw)增高[(1.91±0.58) cmH2O·mL-1·min-1 vs. (0.22±0.12) cmH2O·mL-1·min-1,P<0.05],动态肺顺应性(Cdyn)降低[(1.019±0.004) mL/cmH2O vs. (3.100±1.367) mL/cmH2O, P<0.05]。(2)与正常对照组相比,COPD组小鼠BALF中细胞总数[(5.85±0.67)×108/Lvs.(1.47±0.24)×108/L]、巨噬细胞数(AM)[(4.45±0.63)×108／L vs.(1.34±0.14)×108／L]、中性粒细胞数(N)[(7.76±0.92)×107／Lvs.(0.77±0.09)×107/L]、中性粒细胞所占比例(N%)[(13.7±2.4)%vs.(8.7±1.0)%]均增高(均P<0.05)。(3)病理学观察示COPD组小鼠肺组织肺泡腔扩大、部分肺泡间隔断裂、肺气肿形成,气道上皮排列紊乱、部分气道上皮增生、周围炎症细胞浸润并伴有平滑肌增生。(4)病理形态学定量分析显示：与正常对照组比较,COPD组MLI及DI增高[(51.8±7.3)μm vs.(33.3±3.2)μm,(38.9±4.3)%vs.(12.9±3.2)%,均P<0.05],MAST减低[(4.3±0.6)μm vs.(8.1±1.0)μm, P<0.05]。(5)外周骨骼肌病理显示：COPD组小鼠股四头肌纤维则排列松散,胞浆染色深浅不一,可见胞浆空泡,胞核相对减少伴核内移。与正常对照组比较,COPD组小鼠体重及血清抗氧化能力均降低[(23.1±1.5)g vs.(26.9±0.7)g,(11.2±0.4)U／mLvs.(18.5±0.4)U／mL,均P<0.05],骨骼肌凋亡率增高[(20.6±4.5)%vs.(2.9±0.6)%,均P<0.05]。(7)小鼠体重与血清总抗氧化能力呈正相关(r=0.815,P<0.05),与骨骼肌细胞凋亡呈负相关(r=-0.852,P<0.05)；骨骼肌细胞凋亡与血清总抗氧化能力呈负相关(r=-0.941,P<0.05)。结论单纯烟雾暴露可以成功建立小鼠COPD模型且稳定可靠,与人类COPD相似性高。目的探讨内皮祖细胞(EPCs)对烟雾暴露所致慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠肺功能、气道炎症、肺病理、肺上皮及内皮细胞凋亡、抗氧化能力及基质金属蛋白酶(MMPs)的影响,以了解其对COPD是否有保护作用及机制。方法(1)密度梯度离心分离4周雄性C57BL／6J小鼠骨髓单个核细胞于EGM-2MV中诱导培养成EPCs。(2) 40只6周雄性C57BL／6J小鼠随机分为5组：正常对照组、PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组和EPCs晚期干预组,每组8只。除正常对照组外,其余各组均予香烟烟雾暴露,6支烟／次,4次／d,连续90 d。EPCs早期干预和EPCs晚期干预组分别于烟雾暴露第30 d、第90 d经气道注入30μL 1×105个CM-DiI标记的EPCs进行干预,而PBS早期干预组及PBS晚期干预组在分别于烟雾暴露第30 d、第90 d经气道注入30μL PBS。(3)烟雾暴露停止后第30 d,麻醉各组小鼠,采用PLY3211小动物肺功能检测系统测定肺功能,心脏取血处死小鼠,收集血清、BALF及肺组织标本。肺病理切片HE染色后测定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)；免疫荧光法定位肺组织细胞角蛋白(Pan-cytokeratin); BALF行细胞计数及分类计数；比色法测定BALF及血清总抗氧化能力(T-AOC); TUNEL法检测肺内细胞凋亡水平并计算凋亡指数(apoptotic index,博士学位论文中文摘要AI)；ELISA法检测BALF中MMP-2、MMP-9及TIMP-1水平；免疫组化检测肺组织MMP-2及MMP-9表达；明胶酶谱法测定肺组织MMP-2及MMP-9活性；RT-PCR法检测肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1mRNA表达水平。结果(1)小鼠骨髓来源的单个核细胞在EGM-2MV培养体系中可形成典型“铺路石”样外观及血管样结构并鉴定为EPCs。(2)CM-DiI标记EPCs经气道注入,在小鼠气道及血管可见荧光表达。(3)与正常对照组相比,PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组Raw均增高,Cdyn均降低(均P<0.05)。EPCs早期干预组Raw较PBS早期干预组低,EPCs晚期干预组Raw较PBS晚期干预组低,EPCs早期干预组Raw较EPCs晚期干预组低(均P<0.05)。EPCs早期干预组Cdyn较PBS早期干预组高,EPCs晚期干预组Cdyn较PBS晚期干预组高,EPCs早期干预组Cdyn较EPCs晚期干预组高(均P<0.05)。Raw及Cdyn在PBS早期干预组及PBS晚期干预组间差异无统计学意义(P>0.05)。PEF在各组之间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。(4)PBS早期干预组及PBS晚期干预组肺组织可见明显肺泡腔变大、肺泡间隔断裂、肺气肿形成,EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组病变程度较轻。与正常对照组相比,PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组MAST均降低,ⅦMLI及DI均增高(均P<0.05)。EPCs早期干预组MAST大于PBS早期干预组,而EPCs晚期干预组MAST大于PBS晚期干预组,且EPCs早期干预组MAST大于EPCs晚期干预组(均P<0.05)。EPCs早期干预组MLI及DI均较PBS早期干预组低,EPCs晚期干预组MLI及DI均较PBS晚期干预组低,EPCs早期干预组MLI及DI均较EPCs晚期干预组低(均P<0.05)。MAST、MLI及DI在PBS早期干预组及PBS晚期干预组间差异无统计学意义(均P>0.05)。(5)免疫荧光显示上皮特异标志物细胞角蛋白(Pan-cytokeratin)阳性部位可见CM-DiI红色荧光表达,双阳部位呈黄色或橙色荧光。(6)PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组BALF中细胞总数、巨噬细胞数(AM)、中性粒细胞数(N)及中性粒细胞所占比例(N%)均高于正常对照组(均P<0.05)。EPCs早期干预组BALF中细胞总数、AM及N均较PBS早期干预组及EPCs晚期干预组低(均P<0.05)。EPCs晚期干预组BALF细胞总数、AM、AM%、N及N%较PBS晚期干预组稍低,但差异无统计学意义(均P>0.05)。BALF细胞总数、AM、AM%、N及N%在PBS早期干预组和PBS晚期干预组中差异亦无统计学意义(均P>0.05)。(7) BALF及血清总抗氧化能力在PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组均低于正常对照组(均P>0.05)。EPCs早期干预组BALF及血清总抗氧化能力高于PBS早期干预组,EPCs晚期干预组BALF及血清总抗氧化能力高于PBS晚期干预组均P<0.05)。EPCs早期干预组BALF及血清总抗氧化能力高于EPCs晚期干预组(均P<0.05)。BALF及血清总抗氧化能力在PBS早期干预组和PBS晚期干预组中差异无统计学意义。(8) BALF中MMP-2及MMP-9水平在PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组均高于正常对照组(均P>0.05)。EPCs早期干预组BALF中MMP-2及MMP-9水平较PBS早期干预组低,而EPCs晚期干预组BALF中MMP-2及MMP-9水平亦较PBS晚期干预组低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。EPCs早期干预组BALF中MMP-2及MMP-9水平亦较EPCs晚期干预组低(均P<0.05)。与正常对照组相比,PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组BALF中TIMP-1的水平均减低(均P<0.05)。EPCs早期干预组BALF中TIMP-1的水平较PBS早期干预组高,EPCs晚期干预组BALF中TIMP-1的水平较PBS晚期干预组高(均P<0.05)；EPCs早期干预组BALF中TIMP-1水平亦高于EPCs晚期干预组(均P<0.05)。BALF中MMP-2、MMP-9及TIMP-1水平在PBS早期及晚期干预组间差异无统计学差异(均P>0.05)。(9)各组均可见凋亡细胞。PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组肺泡隔及肺血管内皮AI均较正常对照组高(均P<0.05)。EPCs早期干预组肺泡隔及肺血管内皮AI均较PBS早期干预组低,EPCs晚期干预组肺泡隔及肺血管内皮AI均较PBS晚期干预组低(均P<0.05)。EPCs早期干预组肺泡隔及肺血管内皮AI亦低于EPCs晚期干预组(均P<0.05)。肺泡隔及肺血管内皮AI在PBS早期干预组和PBS晚期干预组中差异无统计学意义。(10)免疫组化显示：与正常对照组相比,PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组肺组织MMP-2及MMP-9表达均增强(均P<0.05)。EPCs早期干预组肺组织MMP-2及MMP-9表达均较PBS早期干预组低,EPCs晚期干预组肺组织MMP-2及MMP-9表达均较PBS晚期干预组低(均P<0.05)。EPCs早期干预组肺组织MMP-2及MMP-9表达亦低于EPCs晚期干预组(均P<0.05)。肺组织MMP-2及MMP-9表达在PBS早期干预组和PBS晚期干预组中差异无统计学意义。(11)明胶酶谱示PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组肺组织MMP-2、MMP-9活性均较正常对照组增高(均P<0.05)。EPCs干预能抑制增高的MMP-2和MMP-9活性,且EPCs早期干预组肺组织MMP-2、MMP-9活性均低于EPCs晚期干预组(均P<0.05)。PBS早期及晚期干预组间肺组织MMP-2及MMP-9活性差别无统计学意义。(12)与正常对照组相比,PBS早期干预组、PBS晚期干预组、EPCs早期干预组及EPCs晚期干预组肺组织MMP-2、MMP-9mRNA表达均增高,TIMP-1mRNA表达减低(均P<0.05)。EPCs早期干预组肺组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达均低于PBS早期干预组,EPCs晚期干预组肺组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达均低于PBS晚期干预组,且EPCs早期干预组肺组织MMP-2、MMP-9 mRNA表达均低于EPCs晚期干预组(均P<0.05)。EPCs早期干预组肺组织TIMP-1 mRNA表达较PBS早期干预组高,EPCs晚期干预组肺组织TIMP-1 mRNA表达较PBS晚期干预组高,且EPCs早期干预组肺组织TIMP-1mRNA表达高于EPCs晚期干预组(均P<0.05)。结论(1) EPCs经气管注入可部分抑制烟雾暴露所致慢性阻塞性肺疾病小鼠气道炎症浸润、肺内细胞凋亡、MMPs表达及活性,提高局部及全身抗氧化能力,改善肺功能,促进肺组织修复,减轻肺气肿程度。(2)EPCs早期干预较晚期干预效果好。