【摘 要】
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目的:将课题组前期经抗人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,RSV）药物高通量筛选平台筛选出的先导化合物6344B-E6进行结构优化后,继续筛选出活性骨架化合物RSV-A-4,并将其与免疫抑制剂代谢产物6-MMPr分别用于抗RSV活性的体内外药效学研究,以期探寻安全、有效的抗RSV小分子化合物并探讨其可能的抗病毒作用机制。方法:（1）采集志愿者呼吸道
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目的:将课题组前期经抗人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus,RSV）药物高通量筛选平台筛选出的先导化合物6344B-E6进行结构优化后,继续筛选出活性骨架化合物RSV-A-4,并将其与免疫抑制剂代谢产物6-MMPr分别用于抗RSV活性的体内外药效学研究,以期探寻安全、有效的抗RSV小分子化合物并探讨其可能的抗病毒作用机制。方法:（1）采集志愿者呼吸道上皮细胞样本,分离细胞后,进行原代人呼吸道上皮细胞（HAEC）的培养,并进行细胞形态、活性鉴定;（2）在人喉表皮样癌细胞系（HEp-2）上,将前期筛选的6344B-E6经免疫斑法和MTS法验证其体外抗RSV活性及细胞毒性后,将其进行结构优化,获得29种衍生化合物;（3）应用上述同样的免疫斑法和MTS法在HEp-2细胞系上筛选衍生化合物库;选取安全系数（SI值）大于10的15种衍生化合物在正常人支气管上皮细胞系（BEAS-2B）上验证其体外抗RSV活性及细胞毒性,最后选取安全系数最高的3-硫代吲哚类RSV-A-4做为活性骨架化合物,并在HAEC上进一步验证其抗RSV活性及细胞毒性;（4）在HAEC细胞株上,采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）与Timeof-addition assay技术探讨RSV-A-4抑制RSV复制的作用机制;（5）以BALB/c小鼠为模型,结合活体成像技术探讨RSV-A-4体内抗RSV的药效学效果;（6）按照上述同样方法,对6-MMPr进行HEp-2、BEAS-2B及HAEC三种细胞系的体外药效学及BALB/c小鼠体内药效学效果检测,并探讨6-MMPr抑制RSV复制的作用机制。结果:（1）培养的HAEC经鉴定后,其体外培养存活率可达93.51%,完全满足后续实验要求;（2）6344B-E6的衍生化合物RSV-A-4在HEp-2、BEAS-2B和HAEC细胞的半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration,IC50）分别为2.51±0.64μM,0.41±0.19μM和207.3±4.77μM,在HEp-2和BEAS-2B细胞的半数细胞毒性浓度（Half maximal cytotoxic concentration,CC50）分别为3038.00±193.24μM和2192.67±168.20μM,而对HAEC细胞则几乎无毒性;6-MMPr在HEp-2、BEAS-2B和HAEC细胞的IC50分别为11.25±0.54μM,1.25±1.17μM和3191±6.106μM,CC50则分别为119.1±23.76μM,148.13±11.90μM和95526±10.97μM;（3）在HAEC细胞中,RSV-A-4和6-MMPr均是在RSV病毒基因组复制阶段抑制RSV的复制;（4）BALB/c小鼠体内药效学实验结果显示,RSV-A-4和6-MMPr均未能在小鼠体内显示其抗RSV感染活性。结论:（1）成功建立了可用于抗RSV药物体外评价的HAEC的培养方法;（2）RSV-A-4和6-MMPr在细胞水平均能有效抑制RSV复制,且都是在病毒基因组复制阶段抑制RSV活性;（3）RSV-A-4和6-MMPr均不能在BALB/c小鼠模型上有效抑制RSV复制。
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