垂体腺瘤(pituitary adenoma,PA)是颅内常见的神经内分泌肿瘤(约占颅内肿瘤10-15%),多起源于垂体前叶,患者临床表现为肿瘤压迫以及肿瘤引起的激素异常分泌导致的症状。PA为单克隆起源的良性肿瘤,虽然其在组织学上为良性,但是部分肿瘤侵袭浸润瘤周组织,呈侵袭性生长,为侵袭性PA。侵袭性PA在生物学行为上更偏向于恶性,且有较强的增殖能力,手术难以完全切除且术后易复发,患者预后差。因此研究调控PA侵袭性发生的分子机制,探索治疗侵袭性PA的新方法具有很现实的临床意义。“瓦伯格效应”指出:肿瘤细胞糖代谢显著高于正常细胞,即使在氧气充足条件下肿瘤细胞也偏向于通过无氧酵解产生能量,这种异常增高的糖酵解与肿瘤的发生发展密切相关。乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)是糖酵解的关键酶之一,其在多种恶性肿瘤中呈高表达,并且调控肿瘤的增殖、侵袭等恶性生物学行为。同时有报道PA的葡萄糖摄取能力显著高于正常垂体,大腺瘤摄取葡萄糖的能力较微腺瘤显著增高。这些证据强烈提示PA增殖侵袭等生物学行为可能与异常糖代谢的密切相关。为了探究LDHA在侵袭性PA发生发展中的的作用及机制,我们首先在PA临床病理标本中检测LDHA的基因及蛋白表达,并且结合临床资料分析LDHA蛋白水平与肿瘤侵袭增殖等生物学行为的相关性;在PA细胞系中探究了LDHA的生物学作用及相应机制;在PA裸鼠模型中体内验证LDHA的作用;选用LDHA特异性化学抑制剂草氨酸盐(oxamate)在PA细胞系、体内动物模型及原代细胞层面探索了其对于PA侵袭及增殖的影响及相关机制。最后我们在PA细胞系GH3中发现应用于临床的抗糖尿病药物二甲双胍(Metformin,Met)显著下调了LDHA基因表达,因此我们进一步利用GH3细胞系及原代PA细胞探究了Met在PA增殖中的作用。通过以上研究我们初步阐明LDHA在侵袭性PA发生发展中的作用,并且探索了可能应用于侵袭性PA治疗的新方法,以期为侵袭性PA临床诊断及治疗开辟新的方向。实验方法:第一部分选取PA临床手术标本,利用q RT-PCR和免疫组化的方法分别检测LDHA在肿瘤标本中基因及蛋白的表达。并且结合临床病例资料分析LDHA蛋白表达与PA侵袭及增殖能力的相关性。第二部分体外培养GH3垂体腺瘤细胞系,慢病毒转染细胞上调LDHA表达,比色法检测各组细胞乳酸产生,行transwell及CCK8实验检测各组细胞的侵袭及增殖能力,并且利用流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布,western-blot检测各组细胞相关蛋白表达。第三部分选取不同浓度LDHA特异性化学抑制剂oxamate处理GH3细胞,比色法及2-NBDG分别检测各组细胞乳酸产生及葡萄糖吸收,transwell及CCK8实验检测各组细胞的侵袭及增殖能力,流式细胞术检测细胞周期分布与凋亡,选用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒测定各组细胞ROS的产生,利用JC-1染色法检测各组细胞线粒体膜电位的变化,western-blot检测各组细胞线粒体凋亡途径相关调控蛋白的表达。建立PA荷瘤裸鼠动物模型,在体研究oxamate对PA体内生长的影响及相关机制。选取PA临床手术标本,培养并鉴定原代PA细胞,oxamate处理原代细胞后检测不同处理组细胞的侵袭及增殖能力。第四部分选用不同浓度Met处理GH3细胞,CKK-8实验检测不同处理组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞周期分布及凋亡,同时对Met处理组细胞行基因芯片分析筛选差异表达基因,对Met诱导GH3细胞凋亡机制进行初步探讨,最后在原代PA细胞中验证Met对PA增殖活性的影响。实验结果:1.LDHA在侵袭性PA中高表达,且与肿瘤的增殖活性正性相关(1)侵袭性PA的LDHA表达水平在m RNA及蛋白层面均显著高于非侵袭性PA。(2)LDHA的蛋白表达与增殖指数Ki-67呈正相关(p<0.05)。2.LDHA促进GH3细胞糖酵解、侵袭及增殖(1)GH3细胞中过表达LDHA可以促进细胞乳酸产生及葡萄糖转运体-1(GLUT-1)的蛋白表达。(2)GH3细胞中过表达LDHA可以促进细胞侵袭及侵袭相关的调控蛋白(MMP-2)表达。(3)GH3细胞中过表达LDHA激活AKT,抑制了GSK3β活性,上调了细胞周期调控蛋白Cyclin D1表达,促进了细胞周期进展,但是对细胞凋亡无明显影响。3.特异性LDHA抑制剂oxamate对PA细胞系GH3、体内PA及原代PA细胞糖酵解、侵袭及增殖的影响(1)oxamate显著降低了GH3细胞乳酸产生、葡萄糖吸收及GLUT-1蛋白表达。(2)oxamate显著降低了GH3细胞侵袭能力并且下调侵袭相关的调控蛋白(MMP2)的表达。(3)oxamate显著降低了GH3细胞增殖活性。(4)oxamate抑制GH3细胞AKT活性,活化了GSK3β活性,下调了细胞周期调控蛋白Cyclin D1表达,阻滞细胞周期于G0/G1期。(5)oxamate诱导了GH3细胞凋亡,促进了细胞内ROS产生,降低细胞线粒体膜电位,上调了Bax及Cleaved-Caspase3蛋白表达,抑制了Bcl-2蛋白表达。ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以逆转oxamate的促凋亡作用。(6)上调LDHA促进GH3细胞体内增殖,oxamate显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长。(7)上调LDHA显著促进体内肿瘤Cyclin D1及MMP2蛋白表达,oxamate抑制了Cyclin D1及MMP2蛋白表达并且促进了凋亡信号分子Cleaved-Caspase3表达。(8)oxamate显著抑制了原代PA细胞的侵袭及增殖活性。4.Met抑制GH3细胞及原代PA细胞增殖(1)Met显著抑制GH3细胞增殖活性。(2)干扰GH3细胞ATF3显著降低了Met诱导的凋亡信号分子Cleaved-Caspase3的蛋白表达。(3)Met有效抑制了原代PA细胞的增殖活性。结论:1.LDHA在侵袭性PA中通常表达上调,且表达水平与腺瘤的增殖活性呈正相关。2.过表达LDHA可以促进GH3细胞糖酵解及侵袭,通过调控AKT-GSK3β-Cyclin D1信号通路可以促进GH3细胞周期进展进而促进细胞增殖。3.特异性LDHA抑制剂oxamate可以有效抑制GH3细胞糖酵解及侵袭,通过调控AKT-GSK3β-Cyclin D1信号通路阻滞GH3细胞周期进展及ROS介导的线粒体凋亡途径促进GH3细胞凋亡。4.Met可以有效抑制PA细胞增殖。