桂花花期不同阶段代谢组与比较转录组分析及花色和花香关键基因的克隆

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桂花(Osmanthus fragrans Lour.)原产我国,是传统十大名花之一。桂花开花时期色彩艳丽花香浓郁,不仅具有极高的观赏价值,同时还是天然香料物质主要来源之一。根据花色和花香变化程度,桂花开花时期可分为四个阶段:初花期、盛花初期、盛花期、盛花末期。目前虽有数个花色和花香相关基因被克隆,但对桂花花色和花香形成的分子调控机制仍不清楚。本研究以桂花‘金玉台阁’为材料,通过对开花四个不同阶段的样本进行非靶标代谢组分析和比较转录组分析,鉴定了大量花色和花香形成相关的基因和代谢途径,并利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了花色相关基因Of F3’H和花香相关基因Of LIS,为揭示桂花花色和花香分子调控机制以及优良桂花品种分子辅助选育等研究奠定了理论基础。具体研究成果如下:1、对桂花‘金玉台阁’花期四个不同阶段的样本进行非靶标代谢组分析。结果显示四个时期共检测到5960个化合物。差异分析显示与初花期相比,在盛花初期有66种代谢物含量发生差异,在盛花期有70种代谢物含量发生差异,在盛花末期有66种代谢物含量发生差异。这些差异物包括L-苯丙氨酸、亚麻酸、亚油酸、赤藓糖、β-谷甾醇等。2、对桂花‘金玉台阁’花期四个不同阶段的样本进行比较转录组分析。去除低质量数据后,初花期桂花文库得到6 342万条clean reads,盛花初期桂花文库得到5 578万条clean reads,盛花期桂花文库得到7 126万条clean reads,盛花末期桂花文库得到4 941万条clean reads,经de novo组装后共得到113 292条unigenes,平均长度为775 bp。在设定阈值下(|log2 Ratio|≥1且FDR≤0.05),在盛花初期、盛花期、盛花末期检测到的差异表达基因数目分别为41、880、1 844个。Gene Ontology(GO)聚类分析显示在盛花初期、盛花期、盛花末期富集的GO类别分别为25、48、47个。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析显示在盛花初期、盛花期、盛花末期富集的KEGG类别分别为6、24、24个。这些基因及代谢通路涉及植物激素与信号传导、类胡萝卜素生物合成、萜类生物合成、苯丙氨酸代谢、淀粉与蔗糖代谢等。此外还从差异表达基因中鉴定了14个类胡萝卜素代谢、类黄酮代谢和香味物质形成相关基因。3、F3’H(类黄酮3’-羟化酶)作为苯丙烷类代谢途径关键成员之一,是细胞色素P450单加氧酶家族的一种,对形成植物色素及调控类黄酮成分起着重要作用。本研究通过c DNA末端快速扩增法(RACE),克隆了桂花‘金玉台阁’c DNA中的Of F3’H基因(Gen Bank编号:MH509392)。序列分析结果显示,该基因编码由520个氨基酸残基组成的蛋白质,全长=1,856 bp,包括5’端非翻译区长度102 bp,3’端非翻译区长度191 bp,开放阅读框(ORF)长度1,563 bp。系统进化分析表明,Of F3’H含有植物F3’H蛋白典型的保守结构域,且与猕猴桃的Ac F3’H蛋白亲缘关系最近。桂花花期不同阶段生理与分子研究发现初花期Of F3’H基因表达量和总黄酮含量均为最低,而盛花末期Of F3’H基因表达量和总黄酮含量达到最高。此外,Of F3’H存在10个潜在的磷酸化位点,其中第83位点的丝氨酸和第304位点的苏氨酸在拟南芥、水稻、大豆、茶树、番茄等多种植物间高度保守。4、芳樟醇是桂花主要香味物质之一,由芳樟醇合成酶(LIS)催化香叶基二磷酸而形成。本研究采用RACE克隆了桂花盛花期小花c DNA中的Of LIS基因(Gen Bank编号:MK563985),编码由840个氨基酸残基组成的蛋白质,全长2,911 bp,包括5’端非翻译区长度126 bp,3’端非翻译区长度262 bp,ORF长度2,523 bp。系统进化分析表明Of LIS含有植物LIS蛋白典型的DDXXD保守结构域和DXXXXXXE保守结构域,且与木瓜的Pa LIS蛋白亲缘关系最近。组织特异性表达分析显示Of LIS基因在花中特异性表达,不同开花时期表达分析显示Of LIS基因在盛花期表达量最高。此外,Of LIS存在17个潜在的磷酸化位点,其中第618位点的酪氨酸位点在拟南芥、水稻、番木瓜、薰衣草等不同植物间高度保守。
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