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创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）发生率高、致残、致死率高,其在平战时的致死率与致残率均居各类创伤之首,给患者、家庭,以及全社会都造成了极大的负担。据估计,每年全球范围至少发生5千万起TBI事故,整体开销接近4000亿美元,约占全球疾病负担的1/3。TBI因其外力因素、受伤机制、病生病理变化以及损伤严重程度的不同而表现出高度的异质性。外力引发的原发性损伤会瞬间破坏脑组织的结构,造成脑挫裂伤、弥漫性轴索损伤,并常引发脑内出血和血肿形成等继发脑损伤,甚至颅内血肿并脑水肿加重,导致颅内压骤升,引起呼吸、循环中枢衰竭。其中,原发性损伤所诱发的一系列继发性的神经化学反应与神经代谢异常,包括兴奋毒性作用、线粒体功能失调、代谢失调、炎症反应、氧化应激反应、脑组织水肿及血脑屏障功能障碍等,更是终致脑功能损伤的复杂多重因素。长期以来,尽管对TBI的治疗做了不懈的探索,但对于重型脑损伤,治疗效果仍差,缺乏突破性的有效策略,一些有潜在效果药物均处于探索阶段。侧脑室旁的室管膜下区（Subventricular zone,SVZ）与海马齿状回的颗粒细胞层下区（Subgranular zone,SGZ）是成年哺乳动物具有的两个富集神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）的神经发生区域。成年SVZ区NSCs也被称作B型细胞,其基底侧延伸并贴附于血管,同时B型细胞会伸出纤毛穿过室管膜细胞层,与侧脑室的脑脊液（Cerebrospinal Fluid,CSF）接触。B型细胞能产生短暂增殖前体细胞（C型细胞）,然后分裂数次成为成神经细胞（A型细胞）。成神经细胞通过喙侧神经迁移流迁移到嗅球,随后再进行放射状迁移并分化成各种亚型的中间神经元。已经有研究证实,局部或全脑脑梗塞后SVZ的神经发生能力会显著提升,提示其对神经损伤修复具有一定的意义。因此,探索SVZ区NSCs在神经损伤修复中的作用机制,充分利用其再生与修复的潜能,将对改善TBI的预后十分有益。MiRNA是一类的内源性非编码单链小RNA,长度约18～22个核苷酸。MiRNA的种子序列与m RNA的3’端非翻译区序列结合,能促进m RNA降解或者抑制转录后的翻译过程,从而调控靶基因的表达。MiRNA的表达具有组织特异性和时序性。在不同的发育时间节点下,不同的组织内miRNA的表达分布是不同的,其发挥的作用也不同。MiRNA不仅参与神经系统发育以及成年哺乳动物的神经发生,而且对中枢神经系统损伤的修复也具有重要调控作用,并有望成为治疗中枢损伤的药物靶点。MiR-124几乎选择性地表达于中枢神经系统,是脑内的特征性miRNA。其在中枢神经系统中的表达水平远高于其他组织,约占全脑miRNA总量的25%-48%。在神经干细胞向成熟神经元分化的过程中,miR-124表达水平逐渐升高,于神经元分化完全时达到高峰,并一直维持高表达状态。将miR-124转染进入Hela细胞可引起174个基因表达下调,并使Hela细胞的基因表达模式更趋近于神经元;向人成纤维细胞中转入miR-124和miR-9可使成纤维细胞转化为神经元。此外,miR-124还可促进轴突向外生长。体内研究结果表明,在成年哺乳动物的神经发生过程中,miR-124的表达变化能直接影响神经元的形成。敲除内源性的miR-124能使NSCs保持分裂前体状态,而过表达miR-124则引起NSCs的早熟并促进其向神经元分化。在神经发育过程中,miR-124基因缺失小鼠会出现大脑体积减小、轴突生长缺陷以及神经细胞死亡等发育表型变化。鉴于miR-124对调控NSCs的增殖与分化具有重要意义,我们认为miR-124能够调节SVZ区NSCs的功能状态并影响TBI的预后。目的:本研究的目的是探索SVZ区miR-124表达变化对TBI预后的影响以及其对TBI后SVZ区NSCs的调控作用,并通过生物信息学分析及体内实验方法探究miR-124发挥功能的内在机制,为改善TBI预后提供新思路。方法:1)建立大鼠脑皮层打击中度损伤模型。通过实时定量PCR方法检测大鼠TBI后SVZ区miR-124表达变化情况。通过免疫荧光法检测SVZ区NSCs标记物Nestin、GFAP、DCX,并检测增殖期细胞标记Ki67,以观察SVZ区NSCs数量及增殖情况。2)利用微量注射器给予大鼠进行双侧脑室miR-124类似物agomir及抑制剂antagomir注射,检测miR-124干扰效果。随后对TBI大鼠进行miR-124干扰,并使用改良神经损伤评分量表（modified Neurologic Severity Score,m NSS）及转棒疲劳实验检测大鼠运动功能恢复情况。通过免疫荧光法检测SVZ区NSCs标记物Nestin、GFAP、DCX,并检测增殖期细胞标记Ki67,以观察SVZ区NSCs数量及增殖变化情况。3)为了分析miR-124的生物学功能,使用在线miRNA靶点预测数据库MiRanda、miRDB及Target Scan预测miR-124可能的靶点,通过综合三个数据库结果筛选出最可靠的靶点并进行KEGG通路富集分析。以此推断miR-124的功能并寻找与NSCs增殖分化相关的通路进行下一步验证。4)通过蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）法检测TBI大鼠SVZ组织miR-124靶通路中关键分子的表达变化情况,以此探索miR-124的功能与作用机制。最后,使用miR-124靶通路上游分子进行联合干预,验证miR-124对靶通路的调控效果。结果:1)成功建立了大鼠TBI模型,q RT-PCR结果显示TBI后成年大鼠SVZ区miR-124表达下降,并长期维持低水平。免疫荧光结果显示,TBI后成年大鼠SVZ区NSCs发生激活,表现为Nestin/GFAP双阳性神经祖细胞数目逐渐增加,DCX+成神经细胞增多,Ki67+增殖期细胞增多。2)双侧脑室注射miR-124类似物或抑制剂后,SVZ区miR-124表达水平发生了改变。MiR-124表达下降可以改善成年TBI大鼠的运动功能预后,并且可以使SVZ区NSCs激活增强。MiR-124表达升高并未明显影响成年TBI大鼠的运动功能预后以及SVZ区NSCs的状态。3)筛选887个miR-124靶基因进行KEGG通路分析,结果显示miR-124靶基因富集的通路为“神经营养因子信号通路”、“催乳素信号通路”等,其中靶点Akt3、Ras、PIK3CA为参与通路最多的分子。因此认为Akt3、Ras、PIK3CA为miR-124下游调控的关键靶分子。4)WB结果显示TBI后SVZ区BDNF、DCX、Akt3、Ras、PIK3CA表达均上调。MiR-124表达下调后,Akt3、Ras、PIK3CA的表达发生进一步上升。此外,miR-124表达下降可使PI3K/Akt3通路及Ras通路下游磷酸化分子表达下降。给与TBI大鼠侧脑室注射神经营养因子BDNF后,大鼠SVZ区NSCs激活增加。同时给与miR-124抑制剂后,NSCs的激活进一步提高,即miR-124表达下降可增强BDNF的促NSCs增殖的效果。结论:TBI后大鼠SVZ区miR-124表达长期下降,且SVZ区NSCs增殖增加。下调SVZ区miR-124表达水平后,大鼠运动功能恢复得到改善,且能进一步增加SVZ区NSCs的激活。进一步发现,miR-124表达下降可以增强BNDF下游通路PI3K/Akt3通路以及Ras通路分子的表达,进而增强BDNF的促NSCs激活的效果。