胎盘是哺乳类胎生动物在妊娠时为胎儿供应养分,供胚胎生长的特殊器官。其组织细胞内含有丰富的类固醇激素,肽类激素,前列腺素,生长因子,细胞因子等胎儿生长所需的物质成分。自从1943年日本京都医院山岛教授从羊胎盘中成功地提取出羊胎素后,对羊胎盘提取液的研究引起了广大学者的浓厚兴趣。近年来研究发现,羊胎盘提取液中富含包括小分子肽类的多种生物活性物质。但是对羊胎盘提取液中功能组分的纯化、功能组分的组成研究的相关报道甚少。本研究采用组织匀浆、反复冻融、冷冻离心、超滤的方法制备羊胎盘提取液；采用加脲的Tricine-SDS-PAGE电泳初步鉴定胎盘肽的存在；采用RP-HPLC逐级分离、纯化羊胎盘提取液肽组分,并采用E-玫瑰花环试验检测各肽组分的免疫活性；用Edman降解法测活性组分N末端氨基酸序列。其目的是通过超滤和反相高效液相色谱将结合的方法分离纯化出有免疫活性的胎盘肽,并对所纯化的羊胎盘肽的免疫活性进行分析和氨基酸序列鉴定,为进一步阐明其生物活性的作用机理和免疫活性小分子肽的进一步研发提供必要的依据。本实验的研究内容如下：1、采用组织匀浆、反复冻融和超滤相结合的方法制备羊胎盘提取液。2、对所制备的羊胎盘提取液进行理化性质鉴定,并采用Tricine-SDS-PAGE电泳方法鉴定羊胎盘肽是否存在。3、采用RP-HPLC方法对所制备的羊胎盘提取液逐一纯化得到纯度比较高的单一组分,并采用E-玫瑰花环实验对各个纯化物进行免疫活性检测。4、对免疫活性高且纯度较高的组分,采用Edman降解法测定N端氨基酸序列。实验结果：1、羊胎盘提取液均为无色或微黄色的透明液体,冷冻干燥后呈疏松多孔的海绵状白色粉末,其PH为6.40±0.02,蛋白质定性反应检测中颜色均变成紫红色,沉淀反应中蛋白质反应呈阴性,电泳结果显示羊胎盘提取液中含有小分子肽类物质,多肽含量为2.14±0.05mg/ml,在190-340nm范围内分别在212nm和253nm附近有两个吸收峰。2、RP-HPLC纯化出3个纯度较高的组分,分别为峰1-5、峰1-7、峰2-3,其纯度分别达到90.6%、91.4%、99.6%。3、通过E-玫瑰花环实验对3个纯度较高组分的活性测定表明峰1-5、峰2-3有免疫活性。Edman降解法测得峰2-3的N端的前10个氨基酸序列为：Trp-Glu-Pro-Asn-Val-Ser-Ala-His-Ala-Phe,将该段氨基酸序列登录美国国立生物技术信息中心,应用BLAST检索工具进行短序列匹配的蛋白质数据库检索,发现没有与此多肽同源的序列,为一新的多肽。该多肽的免疫功能稳定性及其作用机制尚需要进一步的研究。结论：(1)采用反复冻融结合超滤方法获得PH6.40±0.02、多肽含量为2.14±0.05mg/ml羊胎盘提取液。(2)利用RP-HPLC逐级分离纯化羊胎盘提取液,纯化峰1-5、峰1-7、峰2-3三个肽组分,其肽纯度分别为90.6%、91.4%、99.6%。E-玫瑰花环试验检测发现峰1-5、峰2-3组分具有增强脱受体的淋巴细胞恢复其表面受体的功能,促进人外周血T淋巴细胞E玫瑰花环形成,并具有剂量效应依赖关系,表明两个纯化组分具有T细胞免疫活性。(3) Edman降解法测定峰2-3组分的氨基酸测序,发现N端前十个氨基酸序列为Trp-Glu-Pro-Asn-Val-Ser-Ala-His-Ala-Phe,经Blast蛋白质数据库检索发现该多肽为一个新的多肽。