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【研究背景】慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是以不完全可逆的气流受限为特征的一种慢性疾病,其特点是长期炎症导致的气道结构重塑和呼吸气流受限。在细胞层面,组成气道壁的气道内纤毛细胞普遍减少和纤毛长度降低是气道重塑的特征之一。在COPD患者的气道上皮细胞（HBEC）中参与纤毛发育和组装的基因处于低表达模式,导致其HBEC的纤毛分化减少;同时杯状细胞等分泌性细胞增多,进而导致黏液分泌增加;黏液层增厚导致纤毛清除阻力增大,以及纤毛结构的破坏,造成气道管腔狭窄,气道纤毛对吸入细菌和颗粒的清除能力的降低,会增加气道病原菌的附着,伴随而来的受损上皮的免疫力降低,加剧了呼吸道的阻塞、反复感染,气道纤毛长度降低,纤毛细胞占比下降,形成恶性循环。在COPD众多的发病因素中,吸烟是最主要的致病因素。目前的研究表明吸烟后炎症细胞及介质的局部募集,继发性的自由基损害等会对气道纤毛产生毒性,增加气道纤毛超微结构改变的比例。并且卷烟烟雾及其在气道上皮中的分解产物会对纤毛结构蛋白造成损害,但在纤毛生成相关机制的研究并不充分。其中最主要的原因在于纤毛细胞是极性细胞,而大部分机制研究都在浸没式培养条件下完成,在细胞极性环境影响和纤毛生成与功能等方便不具备代表性,因此气液界面培养是最可行的手段。气液界面培养技术能够提供上皮体内的极性环境,获得分化程度高的多种呼吸道上皮细胞。在基底细胞的分化过程中涉及到纤毛细胞中多种基因和蛋白的表达,而对纤毛分化模型的体外机制研究相对较少。因此,卷烟烟雾对人呼吸道纤毛柱状上皮细胞的分子毒理机制就需要我们进行进一步探索。【研究目的】本课题意在研究卷烟烟雾对人支气管上皮纤毛生成关键基因的表达调控。【研究方法】1.气液界面模型的建立与验证:采用多种常见的气道上皮细胞株进行初步气液界面培养,通过纤毛结构分子标志物,筛选具有较强纤毛柱状上皮分化潜力的细胞系,建立体外气液界面研究模型,并对其纤毛特征进行形态学验证。2.采用卷烟烟雾提取物（Cigarette Smoke Extract）刺激气液界面培养分化纤毛后的气道上皮细胞,研究CSE刺激后纤毛生成关键基因的转录和蛋白表达3.分离提取细胞核质和细胞质蛋白,进行Western Blot实验半定量对比,研究卷烟烟雾提取物对相关转录因子入核效率的影响。4.通过免疫沉淀技术,研究卷烟烟雾刺激后目的蛋白的翻译后修饰。5.卷烟烟雾刺激气液界面培养模型细胞后,提取其总RNA进行转录组测序,筛选与纤毛生成关键基因相关的差异性表达基因。构建的mRNA数据库,进行基因互作分析,筛选mRNA数据库中与纤毛生成关键基因相关的差异性表达的基因,并验证基因的表达和蛋白的分泌。6.采用目的基因蛋白直接刺激模型,激活细胞内相关信号通路,研究其对纤毛基因表达调控的影响。【实验结果】1.采用常见的气道上皮细胞株BEAS-2B、NCI-H292、A549和16HBE进行初步气液界面培养、通过纤毛结构分子标志物acetylatead-α-tubulin筛选后,结果显示16HBE显现出了较强的分化潜力。16HBE经气液界面培养后,在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下均有acetylatead-α-tubulin,且集中于细胞气相表面,呈极性分布。扫描电子显微镜下从有丝状物成簇出现在细胞表面。因此从形态学上验证了纤毛的产生,目的细胞株能成功分化成纤毛细胞。2.采用浓度为3%卷烟烟雾提取物刺激细胞后,对纤毛生成基因核心转录因子FOXJ1、RFX3和纤毛内转运复合体主要功能蛋白IFT88进行QPCR实验mRNA相对定量和WB检测,FOXJ1的基因表达差异9H、24H相对降低,RFX3和IFT88基因表达没有明显差异,但FOXJ1的蛋白水平在24h内没有明显差异。在24h内CSE刺激气液界面模型,不能引起细胞内FOXJ1的蛋白水平改变,CSE不能直接对FOXJ1的蛋白水平造成影响。3.分别提取细胞核内总蛋白和细胞质总蛋白后的Western Blot实验提示,CSE刺激9h时,对细胞核内细胞质的FOXJ1蛋白水平的影响差异没有统计学意义,CSE对FOXJ1的入核效率没有抑制作用。4.利用MG132抑制蛋白酶体和CSE混合刺激细胞,在刺激24h时,提取总蛋白进行WB检测。结果提示,CSE+MG132组相较于MG132组升高,有助于抑制FOXJ1蛋白的降解。通过免疫沉淀技术拉取泛素化总蛋白后,对泛素化FOXJ1蛋白进行WB检测。实验结果提示,CSE刺激9h时,刺激组细胞内泛素化FOXJ1相对于对照组明显减少,CSE刺激能够抑制FOXJ1的泛素化水平。5.在卷烟烟雾刺激后的气液界面培养细胞进行转录组测序,引入纤毛基因核心转录因子FOXJ1进行基因互作分析,筛选得出IL6与FOXJ1相关,有IL6-STAT3-FOXJ1的基因互作关系。经过QPCR实验验证IL-6有表达差异即P值＜0.5,呈上调趋势。气液界面培养的细胞气相冲洗液ELISA实验结果提示,IL6在CSE刺激的9H,24H后,胞外分泌增加。6.采用IL6和IL6受体抑制Tocilizumab刺激细胞,在IL6刺激后9h和24h时FOXJ1相对表达量下降。在加入Tocilizumab后,9h时,CSE组相较于CSE和Tocilizumab组下降,提示FOXJ1的下降可能由CSE刺激诱导的IL6表达激活相关通路导致。对IL6刺激后的细胞胞内FOXJ1蛋白的进行Western Blot检测,实验结果提示,在IL6刺激的24h内,IL6信号通路的激活不能引起细胞内FOXJ1的蛋白水平改变。【实验结论】CSE刺激能诱导气道上皮细胞IL6胞外分泌增加,激活IL6信号通路,进而抑制FOXJ1的基因表达。