【摘 要】
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维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种人鱼共患病原菌,给水产养殖业带来巨大损失的同时也给公共卫生带来了巨大威胁,鱼用疫苗因其条件限制,口服疫苗的开发具有重要意义。外膜蛋白A是一种粘附性蛋白,可加强机体杀菌效率,具有良好的免疫原性,具有作为DNA疫苗抗原基因的潜力,但因DNA疫苗蛋白表达量过低,无法刺激机体产生足够强的免疫应答,利用分子佐剂可提高其免疫效果,分子佐剂主要通过激活先天
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维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种人鱼共患病原菌,给水产养殖业带来巨大损失的同时也给公共卫生带来了巨大威胁,鱼用疫苗因其条件限制,口服疫苗的开发具有重要意义。外膜蛋白A是一种粘附性蛋白,可加强机体杀菌效率,具有良好的免疫原性,具有作为DNA疫苗抗原基因的潜力,但因DNA疫苗蛋白表达量过低,无法刺激机体产生足够强的免疫应答,利用分子佐剂可提高其免疫效果,分子佐剂主要通过激活先天性免疫系统来增强抗原效果,包括干扰素、补体分子及白介素等,具有良好前景。本实验克隆了A.veronii TH0426株OmpAⅠ基因,鲤鱼补体C5-Ⅰ与C5-Ⅱ基因,通过SOE-PCR将OmpAⅠ分别与C5-Ⅰ与C5-Ⅱ基因重叠扩增。结果显示,均可扩增出1500 bp左右的融合基因,对融合基因进行原核表达后构建了锚定表达型(Lc-pPG-1-OmpAⅠ-C5-Ⅰ/Ⅱ)和分泌表达型(Lc-pPG-2-OmpAⅠ-C5-Ⅰ/Ⅱ)四种重组干酪乳杆菌。Western boltting结果显示,两种重组乳杆菌均可表达出58 kDa的融合蛋白,间接免疫荧光可在菌体表面检测到荧光信号;为分析重组乳杆菌的免疫应答能力,将重组乳杆菌通过口服饲喂方式对鲫鱼进行免疫,并对免疫0 d、7 d、16 d、25 d、34 d的免疫鲫鱼进行血液及组织采集,通过ELISA对血清中的IgM、AKP、ACP、SOD、LZM指标进行检测,结果表明重组乳酸菌可使免疫鲫鱼血清中IgM抗体水平保持较高水平,且使AKP、ACP、SOD、LZM活性显著上调,说明重组乳酸菌对鲫鱼的体液免疫具有增强作用;同时白细胞吞噬活性较其对照组有明显加强;通过qRT-PCR对免疫鲫鱼各个组织的免疫基因表达量进行测定,结果表明各个组织的IL-10、IL-1β、TNF-α、IFN-γ转录水平均呈明显上升趋势,说明重组乳酸菌可使细胞因子转录水平升高,增强细胞免疫应答;空腹处理7 d后对免疫鲫鱼进行肠道采集,对其前、中、后肠进行平板菌落计数,结果表明重组乳酸菌可在肠道内进行良好定植,随后对免疫鲫鱼腹腔接种A.veronii TH0426,所有免疫组均在一定程度上起到保护作用。分子佐剂C5-Ⅰ与C5-Ⅱ的添加,使之与单独OmpAⅠ基因重组乳酸菌相比其各项免疫指标均有所提高,说明补体C5作为分子佐剂可有效提高重组乳酸菌的免疫效果,在其激活固有免疫的同时有效地促进细胞免疫应答。综上所述,本实验构建的OmpAⅠ基因C5-Ⅰ与C5-Ⅱ为分子佐剂的重组乳酸菌Lc-pPG-1-OmpAⅠ-C5-Ⅰ/Ⅱ与Lc-pPG-2-OmpAⅠ-C5-Ⅰ/Ⅱ,口服免疫后均可使IgM保持较高水平,同时可使血清中酶活性与细胞因子水平呈上升趋势,增强白细胞的分化与吞噬能力,分子佐剂的添加可刺激机体产生更强的免疫应答,提升疫苗的免疫效果。本研究为口服乳酸菌疫苗的开发与利用提供理论基础,为分子佐剂的应用提供依据。
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