猪肠黏膜保护因子的短小芽孢杆菌表达系统建立

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仔猪腹泻的发生主要由肠黏膜屏障功能受损引起。抗分泌因子(Antisecretory factor,AF)、血红素加氧酶-1(Heme oxygenase,HO-1)、肠三叶肽因子(Trefoil factor family 3,TFF3)能修复上皮细胞损伤,在肠黏膜屏障功能维持中发挥重要作用。短小芽孢杆菌表达系统能高效分泌表达外源蛋白,且不产生内毒素,能调节肠道的微生态平衡。自然分离肠黏膜保护因子的成本高、产量和活性较低,很难直接用于工业化生产或作为饲料添加剂使用。本文旨在建立猪肠黏膜保护因子(AF、HO-1、TFF3)的短小芽孢杆菌表达系统,为降低仔猪腹泻发生、保护肠黏膜屏障提供新思路和新方法。利用PCR方法从猪组织中克隆AF、HO-1、TFF3基因,以pNCMO2为载体分别构建重组表达载体pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF,利用电转的方法将重组表达载体pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF转入短小芽孢杆菌,SDS-PAGE和Western Blot方法分析AF、HO-1、TFF3基因在短小芽孢杆菌中的融合表达。结果表明,克隆了猪AF、HO-1、TFF3基因,全长分别为1164bp、897bp、273bp,分别编码387个、298个和87个氨基酸;电泳和测序表明与预期目的基因片段大小一致;成功构建了猪重组表达载体pNCMO2-TFF3、pNCMO2-HO-1、pNCMO2-AF,菌液PCR和双酶切结果鉴定正确;电转后的酶切鉴定结果显示,分别在5200bp处获得pNCMO2载体片段和1164bp、897bp、273bp的目的基因AF、HO-1、TFF3片段;蛋白表达分析SDS-PAGE和Western Blot结果显示,诱导表达蛋白AF、HO-1、TFF3大小分别为46.3KD、36.5KD和13.6KD,与预期大小一致,且为胞外分泌。综上结果提示,成功构建了猪肠黏膜保护因子的芽孢杆菌表达系统,为仔猪腹泻的防治提供了新思路。
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