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棕榈粕属于棕榈油加工副产物,其中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维等营养成分比例适中,因此具有很高的饲用价值,甘露聚糖是主要成分之一,约占干重的35%。由于动物机体内缺乏可降解甘露聚糖的相关酶系,从而导致甘露聚糖成为一种抗营养因子限制动物对饲料中营养物质的吸收利用。β-甘露聚糖酶是一类能催化含有β-1,4糖苷键的半纤维素酶,它能够有效消除饲料中的各种抗营养因子,促进动物对营养物质消化吸收,提高棕榈粕发酵饲料的利用率。其酶解产物甘露寡糖作为一种功能性益生元,可以促进益生菌的增殖。β-甘露聚糖酶的发现为非常规饲料原料如棕榈粕的利用开发开辟了一条绿色、环保、经济的途径。但是β-甘露聚糖酶在农业养殖过程中存在稳定性差、酶活低的问题,容易在饲料加工时的高温环境和动物胃肠道的酸性环境中丧失生物活性,实际应用效果差。因此,本文以实验室保存的一株能高效降解甘露聚糖为低聚寡糖的菌株为研究对象,结合基因工程,分子生物学技术对β-甘露聚糖酶性质展开研究,并基于计算机辅助设计改造其酶学性质,以获得在高温和酸性条件能稳定,高效发挥催化活性的β-甘露聚糖酶,最后利用响应面优化分析β-甘露聚糖酶降解棕榈粕抗营养因子的技术体系,结果如下:（1）本研究以实验室保存的一株能高效降解甘露聚糖的菌株为研究对象,经16Sr DNA鉴定结果表明该株菌属于枯草芽孢杆菌,通过PCR扩增获得编码β-甘露聚糖酶基因并命名为manDL4,属于糖苷水解酶26家族。以Escherichia coli BL21为异源表达宿主菌,通过纯化并研究其酶学特性,结果显示该酶的分子量为41.5 k Da,最适反应p H和温度分别是6.5,60.0℃,在p H 5.0～10.0之间耐受1 h后相对酶活保持在80%以上,温度耐受性显示在60℃,65℃下孵育100 min后,剩余酶活力均在40%以上。（2）借助Disulfide Design 2.0设计出8个潜在的二硫键位点,通过构建突变表达载体,最终获得热稳定性有所改善的突变体,在65℃下manDL4的半衰期为40 min,N304/E332-C,H146/T149-C和T106/D111-C的半衰期分别约为100min、100 min、80 min,分别是野生型的2.5倍、2.5倍、2.0倍,耐受100 min后A303/E332-C剩余67.4%的酶活,但突变体H146/F142-C耐受60 min后酶活显著下降,仅剩余13.5%的相对酶活。在70℃下A303/E332-C、N304/E332-C、H146/T149-C的半衰期分别接近100 min、80 min、55 min,而野生型的接近20min,分别是野生型的5.0倍,4.0倍和2.75倍。但突变体H146/F142-C、H146/N139-C、E105/G145-C、T106/D111-C、I151/Q155-C的温度耐受性均有不同程度的下降。（3）通过多序列比对结合表面电荷优化策略,在保守位点引入突变,结果显示,突变体K322E,Q143R/K322E和L242I的酶活较野生型分别提高了29.6%,25.9%和15.6%,突变体K322E在p H 4.0～12.0之间耐受60 min后的相对酶活保持在90%以上,p H稳定性较野生型有所提高,但是突变体的温度稳定性受到不同程度的影响。V337E、K319E、H346D、Q90E、K339E、N186D在p H4.0的缓冲液中耐受60 min仍能保留70%以上的相对酶活力,而野生型只能保留55%的相对酶活。（4）本研究分析了在不同时间、p H、温度、底物含量、酶添加量条件下manDL4酶解棕榈粕抗营养因子的影响,其中时间、p H、温度对还原糖的含量具有显著影响。再结合响应面分析了manDL4酶解棕榈粕的最优条件,当酶解时间、p H、温度分别为7.46 h、5.46、55.69℃时,在此条件下酶解棕榈粕产生的还原糖含量最高为7.43 mg/m L,获得了生物酶解棕榈粕最佳方案,为生物酶酶解棕榈粕中的抗营养因子提供了一定的实验参考。综上所述,本研究以筛选出的一株能高效降解甘露聚糖菌株为出发研究对象,借助基因工程和分子生物学技术克隆表达并研究了manDL4的酶学性质,通过Disulfide Design 2.0设计引入二硫键后提高了其热稳定性以及理性设计提高了manDL4的酶活力及耐酸性能,最后结合响应面优化了manDL4酶解棕榈粕抗营养因子的技术体系。