【摘 要】
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研究背景严重烧伤病人救治的关键措施是有效的创面覆盖和促进伤口愈合,而大面积烧伤病人常面临自体皮肤不足的突出问题。近年来,基于间充质干细胞（MSCs）的细胞治疗以及构建组织工程皮肤成为解决这一难题的有效方法。而细胞治疗及构建组织工程皮肤需要大量的间充质干细胞,因此,MSCs的快速扩增对于细胞治疗及构建组织工程皮肤有重要意义。人间充质干细胞来源于包括骨髓、脂肪组织和脐带等多种组织。其中,来源于脐带组织
【基金项目】
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广东省科技计划项目（2017A020215042）；
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研究背景严重烧伤病人救治的关键措施是有效的创面覆盖和促进伤口愈合,而大面积烧伤病人常面临自体皮肤不足的突出问题。近年来,基于间充质干细胞（MSCs）的细胞治疗以及构建组织工程皮肤成为解决这一难题的有效方法。而细胞治疗及构建组织工程皮肤需要大量的间充质干细胞,因此,MSCs的快速扩增对于细胞治疗及构建组织工程皮肤有重要意义。人间充质干细胞来源于包括骨髓、脂肪组织和脐带等多种组织。其中,来源于脐带组织的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）,与其他来源的MSCs相比,具有更高的增殖分化能力、更低的免疫原性且方便取材等优势,可作为组织工程皮肤的最佳种子细胞之一。通过无血清培养基培养的hUC-MSCs,可保持稳定的MSCs细胞形态和表面标记物表达及高增殖潜能,降低动物血清所带来的外源性致病因子及免疫排斥的风险,有助于我们获得更安全有效的细胞产品。ROCK抑制剂Y-27632可促进人胚胎干细胞（hESCs）、骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）和上皮细胞等多种类型细胞的体外增殖能力,抑制细胞衰老进程,是提高细胞增殖能力的有效方法。但目前国内外尚无ROCK抑制剂Y-27632对hUC-MSCs增殖和衰老影响的相关研究报道。目的通过研究Y-27632对无血清培养条件下的hUC-MSCs增殖及衰老的影响,初步探讨其作用机制,找到一种可快速体外扩增hUC-MSCs的方法。方法从脐带中分离获得hUC-MSCs,在无血清培养基中进行传代培养,对细胞进行生物学鉴定（观察细胞的形态及生长情况,流式细胞学检测hUC-MSCs的表面标记物CD90、CD105、CD34和HLA-DR,检测其成骨、成脂及成软骨分化潜能）。将细胞随机分为实验组和对照组,实验组添加10μMY-27632,对照组加入等量DMSO液。计算各代的细胞总数,绘制细胞增殖曲线;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞学检测细胞周期,计算细胞增殖指数;ELISA检测细胞上清液中表皮生长因子（EGF）及血管内皮生长因子（VEGF）含量;β-半乳糖苷酶染色法及Western Blot法检测p16、p21蛋白,以检测细胞的衰老情况。结果1、本研究从脐带华通氏胶分离获得hUC-MSCs,经无血清培养基培养后,具有良好的体外增殖能力及三系分化潜能,并可稳定表达细胞标志物,符合国际细胞疗法学会的间充质和组织干细胞委员会提出的MSC标准。2、在P3及P8代中,实验组的细胞总数均明显高于其相应对照组（P＜0.05）;在各代样本中,实验组的细胞倍增值均高于对照组（P＜0.05）;在P3、P8、P12代细胞中,随细胞传代次数增加,Y-27632促增殖作用越显著。3、与对照组相比,Y-27632可加速hUC-MSCs的细胞周期进程,提高S期及G2/M期的细胞百分率（P＜0.01）。4、Y-27632 可促进 hUC-MSCs 对 EGF 及 VEGF 的分泌（P＜0.05）。5、Y-27632降低了 hUC-MSCs的β-半乳糖苷酶染色阳性细胞百分率（P＜0.05）,抑制p16及p21的表达。结论Y-27632可促进无血清培养条件下hUC-MSCs的增殖,抑制hUC-MSCs的衰老。
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