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中药现代化研究是我国当前的一个研究重点,是中医药现代化、国际化和产业化的基础。其中,中药制剂和生物体液中中药活性成分研究可为建立现代中药质量控制方法和药理、临床研究以及新药开发研究提供基础。本文以异黄酮类活性成分为对象,对中药制剂和生物体液中异黄酮类化合物的分析方法进行了研究,建立了异黄酮类化合物的免疫分析方法和样品纯化、提取的方法。本论文包括以下几个部分:
第一章:在参考了148篇国内外相关文献的基础上,综述了近年来中药制剂及活性成分提取、检测研究的概况;对异黄酮类化合物生物活性及检测方法研究进行了系统总结,在此基础上确定了论文的选题。
第二章:建立了异黄酮类化合物大豆苷元的生物素-亲和素酶联免疫吸附法(BA-ELISA)。将大豆苷元7位羟基活化引入羧基,与载体蛋白BSA上的游离氨基偶联制备了全抗原。动物免疫制得了针对大豆苷元结构特征的特异性多克隆抗体。利用ELISA方法对制得的抗血清效价进行测定,测得其中点效价为2×104。采用辛酸-饱和硫酸铵法对抗体进行纯化,纯化抗体IgG浓度为18.1mg/mL,抗体-抗原亲和常数为1.6×108L/mol。对抗体的特异性进行评价,葛根素、卢丁等结构类似物的交叉反应均在1%以下。对BA-ELISA方法进行条件优化,封闭液改用5%脱脂奶粉。采用logit-log法对测定结果进行线性回归,线性范围为0.1-1,000ng/mL,测定上述BA-ELISA方法的检出限为0.04ng/mL。实验测得日内相对标准偏差为7%;日间相对标准偏差为16%。将建立BA-ELISA方法用于模拟人血清样品和健康人尿液样品中大豆苷元的分析检测,测得回收率在91-107%之间。对中药葛根中大豆苷元的含量也进行了测定,与高效液相色谱方法进行对照,得到两种方法所得结果的相对值为113%[(BA-ELISA测得含量)/(HPLC测得含量)]。
第三章:将纯化抗体偶联到溴化氰活化的Sepharose4B上,制备了针对异黄酮类化合物大豆苷元的免疫亲和柱。对免疫亲和柱保留性能影响因素进行考察,得出在0.05%Tween20溶液为缓冲液时保留效果最佳。大豆苷元标样经亲和柱纯化后的回收率为91.3%。该免疫亲和柱用于模拟人血清样和尿样中大豆苷元的纯化分离,蛋白等于扰物基本被除去;用于中药葛根提取液中大豆苷元的纯化分离,基体干扰可除去相当部分,表现出一定的纯化效果。
第四章:将浊点萃取法用于中药和生物体液中大豆苷元的提取和浓缩。优化了中药葛根中大豆苷元浊点萃取的条件,采用5%GenapolX-080溶液、液/固比为25mL/g时超声提取45min萃取效果最佳。考察了温度和电解质加入量对提取液中大豆苷元浓缩效果的影响:当NaCl加入量达到0.2g/mL以上时,大豆苷元的浓缩因子可达到13左右;水浴温度为50℃,最终定容后的浓缩倍数为10倍。该法测定中药葛根中活性成分大豆苷元回收率为100.3%,RSD=0.7%(n=3)。将该浊点萃取法应用于血清样和尿样中大豆苷元的萃取浓缩,无乳化现象,定容后的浓缩倍数为10倍,回收率分别是94.9%和98.4%。
第五章:探讨了中药制剂活性成分的提取方法和中药制剂质量控制方法。系统比较了微波辅助提取和超声提取这两种提取方法,以中药制剂通脉冲剂为考察对象,对两种提取方法的条件进行了优化。微波辅助提取溶剂为30%乙醇(pH2.5),微波辐照功率和时间分别为750W和2min;超声提取的提取溶剂也是30%乙醇(pH2.5),提取时间为30min。两种提取方法所得结果相互吻合。采用高效液相色谱首次同步测定了中药复方制剂心可舒片中的四种活性成分(葛根素、大豆苷元、丹参素和原儿茶醛)和通脉冲剂中的三种水溶性活性成分(葛根素、丹参素和阿魏酸),建立了这两种中药复方制剂的质量控制方法。本论文主要创新之处在于:
(1)首次建立针对大豆苷元的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法(BA-ELISA),方法灵敏度明显优于现有报道的酶联免疫吸附法;将该方法用于中药中异黄酮类活性成分大豆苷元的检测,结果良好,为中药及中药制剂中活性成分的高通量筛选提供了一种快速、便捷的方法。
(2)制备了针对异黄酮类化合物大豆苷元的免疫亲和柱,用于生物体液样品的分离纯化效果理想;尝试将该亲和柱用于中药葛根提取液中大豆苷元的纯化,表现出明显的分离纯化效果,为中药及中药制剂中活性成分分析提供了一种样品初步分离纯化的方法选择。
(3)首次将浊点萃取法用于中药葛根中异黄酮类化合物大豆苷元的萃取、浓缩分析,尝试了浊点萃取法新的应用领域;将浊点萃取法用于生物体液中大豆苷元的萃取浓缩效果理想,为生物体液样品的预处理提供了一种方法选择。
(4)系统比较了微波辅助提取和超声提取两种提取方式,将其应用于中药复方制剂中活性成分的提取,效果理想;首次同步测定了中药复方制剂心可舒片和通脉冲剂中数种活性成分,建立了二者的质量控制方法。