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目的：白芍总苷（Total glucosides of paeony，TGP）是自白芍根中提取的有效部位，以芍药苷（Paeoniflorin，Pae）和芍药内酯苷（Albiflorin，Alb）的含量最高。课题组前期比较了TGP在正常和急性CCl4肝损伤大鼠体内的药代动力学参数，发现其在正常和病理状态下的参数明显不同，并对TGP的胃肠吸收、血浆蛋白结合率、组织分布等特点进行了研究。为进一步研究TGP的药代动力学，明确其体内排泄特点，研究TGP对肝药酶CYP3A蛋白表达的影响，本实验以HPLC法为手段，采用固相萃取方法同时测定Pae和Alb在大鼠尿液、粪便和胆汁中的含量，明确TGP的主要排泄途径，同时以正常大鼠和急性CCl4肝损伤大鼠为实验对象，采用Western Blot法观察TGP对大鼠CYP3A蛋白表达的影响，探讨TGP保肝作用的相关机制。方法：1白芍总苷在大鼠体内的排泄研究1.1色谱条件采用phenomenex C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流动相均为乙腈-0.1%冰乙酸，尿液样品流动相比例为16:84，粪便及胆汁样品比例均为13:87；流速1mL/min；检测波长232nm；柱温25℃；进样量均为10μL。1.2样品预处理1.2.1尿样预处理精密量取尿样0.4mL，加入蒸馏水0.2mL及内标龙胆苦苷溶液20μL，涡旋混匀后通过已活化的固相萃取小柱，先用10%的甲醇2mL淋洗杂质，继用甲醇1mL洗脱，洗脱液定容至1mL，离心（12000r/min），取上清液10μL进样分析。1.2.2粪便预处理将粪便样品于-40℃保存24h以上，冷冻干燥，称定重量，研碎，取粪便冻干粉0.01g，加入1mL蒸馏水，涡旋混匀5min，离心（12000r/min）10min，取上清液0.2mL，加入蒸馏水0.2mL及内标龙胆苦苷溶液20μL，涡旋混匀，其余处理同“尿样预处理”。1.2.3胆汁预处理取胆汁样品0.2mL，其余操作同“尿样预处理”。1.3排泄研究1.3.1TGP在大鼠尿液和粪便中的排泄Wistar大鼠5只，置代谢笼中，灌胃给予TGP水溶液（1.41g/kg），分别收集各时间段尿液及粪便，HPLC法测定样品中Pae和Alb浓度，根据随行标准曲线计算各自含量。1.3.2TGP在大鼠胆汁中的排泄大鼠灌胃给予TGP水溶液（1.41g/kg），腹腔注射25%乌拉坦麻醉，分离胆总管并行胆管插管引流术，收集各时间段的胆汁，HPLC法测定样品中Pae和Alb浓度，根据随行标准曲线计算各自含量。2白芍总苷对正常大鼠CYP3A蛋白表达的影响25只大鼠按体重随机分为5组（正常对照组，TGP低、中、高剂量组，阳性对照组）。正常对照组给予纯化水，TGP低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予TGP0.47、1.41、2.82g/kg，连续14天；阳性对照组于第11天腹腔注射地塞米松75mg/kg，连续4天。第15天将各组大鼠断头处死，取肝，差速离心法制备肝微粒体，Western Blot法检测CYP3A蛋白表达。3白芍总苷对急性CCl4肝损伤大鼠CYP3A蛋白表达的影响30只大鼠按体重随机分为6组（正常对照组，模型组，TGP低、中、高剂量组，阳性对照组）。正常对照组与模型组给予纯化水，TGP低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予TGP0.47、1.41、2.82g/kg，阳性对照组大鼠给予联苯双酯0.2g/kg，连续14天。于末次给药后2h，除正常对照组注射等量生理盐水，其余5组均皮下注射50%CCl4玉米油复制急性CCl4肝损伤模型，16h后将大鼠断头处死，取血分离血清测定ALT、AST；取肝，称总重，计算肝脏系数；肝左叶的相同部位用10%甲醛溶液固定，常规石腊包埋，HE染色，光镜下观察组织损伤程度；部分肝组织差速离心法制备肝微粒体，Western Blot法检测CYP3A蛋白表达。结果：1白芍总苷在大鼠体内的排泄研究1.1方法学考察大鼠尿液、粪便和胆汁中Pae、Alb及内标峰在本条件下专属性良好，阴性无干扰，日内和日间精密度RSD均在10%以内，准确度均在90%～110%之间，两者及内标的提取回收率均在90%以上，样品预处理前后室温放置和冻融循环后仍保持稳定。1.2TGP在大鼠尿液、粪便和胆汁中的排泄大鼠灌胃给予1.41g/kg TGP后，48h尿液和粪便及36h胆汁中芍药苷的累积排泄量分别为（610.0±53.9）、（60630.4±4546.3）、（5640.3±504.3）μg，占给药量的（0.583±0.042）%、（59.11±6.87）%和（4.88±0.43）%；芍药内酯苷的累积排泄量分别为（158.0±21.1）、（27315.1±2383.4）、（2462.1±211.2）μg，占给药量的（0.424±0.056）%、（74.70±9.17）%和（5.98±0.48）%。2白芍总苷对正常大鼠CYP3A蛋白表达的影响与正常对照组相比，阳性对照组给予地塞米松能够显著诱导CYP3A的蛋白表达（P<0.01），比正常对照组提高140%；TGP低、中剂量组较正常对照组有增高趋势，分别较正常对照组提高9%、19%，但无统计学差异（P>0.05）；TGP高剂量组显著诱导CYP3A的蛋白表达，比正常对照组提高44%（P<0.01）。3白芍总苷对急性CCl4肝损伤大鼠CYP3A蛋白表达的影响3.1TGP对急性CCl4肝损伤大鼠肝脏系数的影响与正常对照组相比较，大鼠皮下注射CCl4后，模型组大鼠肝脏系数明显上升，显著高于正常对照组大鼠（P<0.01）；与模型组比较，经TGP与DDB预处理能显著降低肝损伤所致肝脏系数上升（P<0.05或P<0.01）。3.2TGP对CCl4所致大鼠急性肝损伤肝功能的影响与正常对照组比较，模型组大鼠ALT、AST值明显升高（P<0.01）；与模型组比较，预先给予TGP或DDB，能够显著降低ALT、AST水平（P<0.05或P<0.01），且TGP高剂量组和阳性对照组疗效明显优于TGP低、中剂量组。3.3TGP对CCl4所致大鼠急性肝损伤肝组织病理学观察正常对照组大鼠肉眼观察肝脏形态正常，色泽红润，边缘整齐，质地柔软；镜下可见肝小叶结构正常，肝细胞排列整齐且胞核形态正常，肝细胞索清晰可辨，未见肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理改变。模型组大鼠肉眼见肝脏体积肿大，灰暗呈土黄色，边缘变钝，质脆；镜下见肝小叶正常结构被破坏，肝组织结构紊乱，细胞境界不清并出现气泡样变，细胞索解离，肝细胞肿胀，出现弥散性炎症细胞浸润；TGP各给药组和阳性对照组均不同程度地减轻上述病理改变。3.4TGP对急性CCl4肝损伤大鼠CYP3A蛋白表达水平的影响与正常对照组相比，模型组CYP3A的蛋白表达明显减少，较正常对照组下降31%（P<0.01）；阳性对照组给予DDB显著诱导CYP3A的蛋白表达，比模型组提高59%（P<0.01）；TGP低、中、高剂量组亦显著诱导CYP3A的蛋白表达，分别较模型组提高16%（P<0.05）、30%（P<0.01）、52%（P<0.01）。结论：1大鼠灌胃给予1.41g/kg TGP，尿液、粪便及胆汁中芍药苷的累积排泄量分别占给药量的（0.583±0.042）%、（59.11±6.87）%和（4.88±0.43）%；芍药内酯苷的累积排泄量分别占给药量的（0.424±0.056）%、（74.70±9.17）%和（5.98±0.48）%。表明TGP在体内主要经胆汁排泄。2正常大鼠灌胃给予低、中、高（0.47、1.41、2.82g/kg）剂量TGP连续14天，24h后制备肝微粒体，Western Blot法检测CYP3A的蛋白表达。TGP低、中剂量组较正常对照组有增高趋势，但无统计学意义；TGP高剂量组明显诱导CYP3A的蛋白表达，较正常对照组提高44%，提示TGP的保肝机制可能与此有关。3实验发现CCl4能够显著降低大鼠CYP3A蛋白表达水平，较正常对照组下降31%，提示CYP3A蛋白表达水平下降可能与肝损伤关系密切；预防性给予大鼠低、中、高剂量TGP连续14天，可明显改善CCl4所致的大鼠急性肝损伤，显著上调CYP3A蛋白表达水平，推测其为TGP治疗肝损伤的机制之一。