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研究背景：骨肉瘤是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤之一,其恶性程度较高,发现时常已有微小肺转移,预后普遍较差,而且缺乏有效的治疗手段。而骨肉瘤的基因治疗是最有希望的治疗方法之一,在综合治疗中也是极其重要的部分。其中,自杀基因(suicide gene)/前药(prodrug)系统受到广泛的重视,单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)系统是目前研究最多的用来评价自杀基因的治疗效果。但是操作复杂,有危险性,故选择经济、相对安全的Lipofectamine2000脂质体介导的转染方法,将重组质粒pIRES-EGFP-tk成功导入人骨肉瘤U-2细胞中。在自杀基因系统的旁观者效应(Bystander effect)更是引起肿瘤消退的重要因素,该系统的治疗机制是通过基因转移载体将自杀基因导入肿瘤细胞中,自杀基因表达蛋白,在这种蛋白作用下,在肿瘤组织局部激活本身无毒或低毒的前药(prodrug),将其转化为具有高度毒性的代谢产物,从而将肿瘤细胞杀灭。旁观者效应的物质基础是细胞缝隙连接(GJ),GJ由六个表达在细胞表面的同亚型连接蛋白(Cx)构成的。同类细胞间的GJ传导能量或信息作用最强,由它介导的细胞间通讯(GJIC)可以决定细胞的正常分化和生长。Cx表达低下或位于胞浆内时,功能性GJ就不能形成。当GJIC功能低下时，提示细胞恶性生长、增殖或异常分化。骨肉瘤细胞中的Cx43蛋白的浓度与肿瘤细胞的分化程度成正相关,提示Cx43能影响骨肉瘤细胞的发展。因此,我们可以以Cx43蛋白的变化来观察plRES-EGFP-TK/GCV系统的旁观者效应,plRES-EGFP-TK/GCV系统抗肿瘤效果不明显,或对某些肿瘤细胞无效的原因可能TK基因转染效率低或旁观者效应低。旁观者效应可以通过基因转染Cx基因或化学辅助方法来提高。据目前研究Cx基因转染效率不是很高,所以诱导Cx表达的化学诱导剂则应用更广泛，这些诱导剂一般对机体无毒或毒性极低,包括维甲酸、cAMP、类胡萝卜素、糖皮质激素等,在诱导Cx表达时存在细胞组织特异性和Cx类型特异性。全反式维甲酸作为一种良好的诱导剂和分化剂,与常规化疗药相比,副作用低,不良反应较少,还能明显的降低肿瘤的恶性程度。本实验我们以人骨肉瘤U-2细胞株为研究对象,全反式维甲酸作用后,观察人骨肉瘤U-2细胞膜上Cx43蛋白含量的变化,从而观察全反式维甲酸能否增强plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的杀伤力和旁观者效应。目的：观察全反式维甲酸联合脂质体介导的TK/丙氧鸟苷(GCV)系统对人骨肉瘤U-2细胞旁观者效应的影响。方法：订购重组质粒plRES-EGFP-TK,培养和转染人骨肉瘤L2细胞株,荧光倒置显微镜和流式细胞仪观察转染后细胞生长状态,四甲基偶氮哇蓝(MTT)法检测plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的生长抑制率,以及联合ATRA与否是否增强其旁观者效应,ELISE检测细胞培养液中连接蛋白(CX)43的表达情况。结果：ATRA可以抑制U-2细胞生长,当终浓度为10-(?)mol/l时,明显降低细胞存活率,形态学上主要以细胞凋亡形式出现;当终浓度为10-7mol/1时,无抑制细胞生长作用。ATRA抑制U-2细胞生长呈浓度一时间依赖性(p<0.05)。plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞旁观者效应在TK+:TK-细胞混合比例为5：5时明显出现(p<0.05),而联合ATRA后,在TK+:TK细胞混合比例为3：7时就明显出现(p<0.05),且在细胞生存率均在50%的时候,TK+细胞比例可下降20%。ATRA (10-6mol/1)处理人骨肉瘤U-2细胞24h、48h、72h后,Cx43蛋白的浓度分别为O.559±0.018ng/ml,0.654±0.023ng/ml.,0.826±0.065ng/ml(p<0.01)结论：全反式维甲酸可能通过增强CX43的表达,提高plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的杀伤效应。