1.研究背景及目的肝豆状核变性(Wilson disease, WD)是常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病,wD好发于青少年,临床上以慢性肝脏损害、肾脏功能病变及神经系统障碍等症状为主要表现。研究表明,肝脏是wD最先累及的脏器之一,发病年龄越早,以肝脏病变为唯一临床表现的可能性越大,肝纤维化(Hepatic Fibrosis)几乎是每个wD患者肝脏损害的主要病理改变。wD作为铜代谢障碍性疾病,发生肝纤维化的根本原因是铜离子向胆道排泄困难,造成游离铜在肝组织内缓慢蓄积。研究证实肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的激活是肝纤维化发生的主要环节,激活的HSC大量增殖,发生表型改变、分泌过多的细胞外基质(Extra Cellular matrix, ECM)沉积于肝脏是肝纤维化形成的关键。在HSC信号通路研究中,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)是近年研究的热点。p38MAPK信号通路是MAPK介导的信号通路的重要分支,主要参与炎症、增殖、凋亡等多种生理过程,是目前调控细胞凋亡的关键通路之一。代谢组学日益成为整体性研究生命体系功能变化的非常有力的分析手段。由于wD为铜代谢障碍性疾病,其代谢物谱的变化可能不同于其他肝脏疾病,因此wD的代谢组学研究对于wD的病机、治疗及预后显得尤为重要。目前肝纤维化的防治特别是wD肝纤维化尚缺乏针对性较强的特效手段,而中医中药以其多靶点的整体调节和以人为本的个性化治疗方案,在肝纤维化的防治中具有独特的疗效。导师所在课题组在前期的临床实践中证明：通腑利湿、化瘀散结的中药专方肝豆灵可以改善wD患者的肝纤维化指标,促进wD者肝硬化及肝功能的恢复。本实验主要开展以下研究：建立铜负荷大鼠模型,观察通腑利湿、化瘀散结方肝豆灵对肝纤维化HSC凋亡及p38MAPK信号通路蛋白表达的影响,运用代谢组学技术检测肝豆灵对铜负荷大鼠肝纤维化小分子代谢标志物变化的影响,初步探讨通腑利湿、化瘀散结方肝豆灵治疗wD肝纤维化的分子机制。2.方法2.1实验分为5组：分别为空白对照组,模型对照组,肝豆灵组,肝豆灵加青霉胺组,青霉胺组；2.2按照文献复制铜负荷大鼠模型；2.3使用通腑利湿、化瘀散结方肝豆灵对各治疗组铜负荷大鼠进行干预,选用青霉胺为阳性对照药物；2.4光镜观察肝纤维化病理改变；2.5采用免疫组化法、Western-Blot法检测p38MAPK蛋白的表达,TUNEL法检测细胞凋亡；2.6运用1H-NMR技术检测肝纤维化大鼠血清、尿液的小分子代谢产物的变化。3.结果3.1通腑利湿化瘀散结方肝豆灵对铜负荷大鼠肝纤维化病理的影响空白组肝小叶结构完整,肝细胞排列规则,小叶内无细胞变性,无炎性细胞浸润；铜负荷大鼠模型组HE染色汇管区可见明显纤维组织增生,各治疗组肝纤维化程度明显减轻；Masson染色光镜下为绿色为胶原纤维,正常对照组中央静脉管壁可见少量绿色的胶原纤维,模型组于汇管区和中央静脉管壁可见大量粗大的绿色的胶原纤维,与正常对照组相比有显著性意义(P<0.01),各治疗组肝纤维化程度明显减轻,其中肝豆灵加青霉胺组积分下降最为显著(P<0.01),肝豆灵组和青霉胺组病理积分亦明显下降(P<0.05)。3.2通腑利湿化瘀散结方肝豆灵对铜负荷大鼠HSC的影响TUNEL法检测细胞凋亡,空白组未见明显HSC增生,模型组可见大量HSC增生表达,各治疗组可见HSC凋亡细胞表达,各治疗组凋亡指数较模型组明显增高,其中肝豆灵加青霉胺组凋亡指数显著增高(P<0.01),肝豆灵组和青霉胺组凋亡指数亦明显升高(P<0.05)。3.3通腑利湿化瘀散结方肝豆灵对铜负荷大鼠P38MAPK信号通路的影响3.3.1免疫组化法检测p38MAPK信号通路表达p38MAPK蛋白阳性信号呈棕黄色,模型组及各治疗组可见阳性细胞表达,模型组阳性细胞数表达较空白组显著增强(P<0.001),青霉胺加肝豆灵组、肝豆灵组及青霉胺组较模型组p38MAPK阳性细胞数表达显著减少(P<0.05),组间比较无显著差异。3.3.2Western-Blot法检p38MAPK信号通路表达p38MAPK蛋白水平在各组之间比较有明显差别,与空白组相比,模型组及各治疗组可见p38MAPK特异性蛋白条带表达,模型组较空白组阳性蛋白相对表达量显著增强(P<0.001),青霉胺加肝豆灵组、肝豆灵组及青霉胺组与模型组比较阳性蛋白相对表达量显著下降,具有统计学意义(P<0.01),组间比较无显著差异。3.4通腑利湿化瘀散结方肝豆灵对铜负荷大鼠代谢组学的影响3.4.1对血清特征性代谢物的影响模型组较空白组含有较多的乳酸盐、糖蛋白、脂质、牛磺酸、丙酮酸盐,模型组较空白组含有较少的葡萄糖、胆碱、甜菜碱、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、肌醇,通腑利湿化瘀散结方肝豆灵能明显提高铜负荷大鼠血浆亮氨酸、异亮氨酸、胆碱、葡萄糖、3-羟基丁酸的含量,能降低糖蛋白、脂质、乳酸盐、丙酮酸盐的含量,通腑利湿化瘀散结方肝豆灵对铜负荷大鼠小分子代谢物有明显的调节效应,对wD肝纤维化的代谢异常有修复的作用。3.4.2对尿液特征性代谢物的影响模型组较空白组含有较多的乳酸盐、脂质、牛磺酸、三甲胺、肌氨酸、肌酐,含有较少的氧化三甲胺、马尿酸盐,通腑利湿化瘀散结方肝豆灵能明显提高铜负荷大鼠尿液氧化三甲胺、马尿酸盐的含量,降低乳酸盐、脂质、牛磺酸、肌氨酸、肌酐、三甲胺的含量。尿液的特征性代谢物的变化,不仅能够反应wD铜负荷大鼠肝脏本身损害,也可同时提示肾脏及其他脏器损害,与wD多脏器损害的病理特点相一致。4.结论4.1本研究采用铜负荷方法建立了铜过量负荷大鼠模型,模型组可见肝纤维化病理改变,该模型可反应铜过量沉积导致肝损伤的病理机理。4.2本研究发现铜过量负荷大鼠模型可见HSc增生表达,各治疗组凋亡指数较模型组明显升高,提示通腑利湿、化瘀散结方肝豆灵对铜负荷大鼠有诱导HSc凋亡的作用,特别是和青霉胺合用作用更显著。4.3本研究发现模型组有p38MAPK信号通路蛋白的阳性表达,各治疗组较模型组明显改善,而在空白对照组无相应改变。提示：铜负荷大鼠肝纤维化时p38MAPK被激活,可能参与了wD铜负荷大鼠肝纤维化发生、发展的过程,通腑利湿、化瘀散结方肝豆灵可能通过对p38MAPK信号通路的抑制作用而发挥抗纤维化改善肝功能的作用。4.4采用基于1H-NMR的代谢组学方法研究通腑利湿化瘀散结方对铜负荷大鼠的血清和尿液的干预作用,得到了乳酸、牛磺酸、胆碱、脂质等特征代谢物,通过对这些特征代谢物的代谢途径的分析发现,铜不仅影响了糖、脂类和蛋白质的代谢,也导致了氨基酸等其它代谢系统的紊乱,通腑利湿化瘀散结方肝豆灵对铜负荷大鼠小分子代谢物是多途径、多靶点的代谢网络调节,对铜负荷大鼠小分子代谢物有明显的调节效应,对wD肝纤维化的代谢异常有修复的作用。