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研究目的:宫颈癌是全球女性最常见的肿瘤之一,尽管已经有组织筛查计划和人乳头瘤病毒疫苗的接种的国家宫颈癌发病率显着降低,但由于发展中国家缺乏普遍、高质量筛查的资源,宫颈癌仍然是全球女性癌症死亡的第二大常见原因[1,2]。全球估计每年有528000例宫颈癌诊断,导致大于260000例死亡,全世界超过85%的病例来自发展中国家[1,3]。基于铂的药物,特别是顺-二氨基-二氯铂(II)(顺铂,DDP),用于治疗许多癌症,包括宫颈癌[4]。其作用方式与其与DNA上的嘌呤碱基交联的能力有关,干扰DNA修复机制,引起DNA损伤,随后诱导癌细胞凋亡[5,6]。顺铂还可以导致细胞周期停滞,衰老和细胞凋亡,这统称为DNA损伤反应(DDR)[5]。顺铂治疗最初是成功的,但通常会因为癌细胞的获得性或固有性方式产生对药物的耐药性[7,8],使得治疗失败。顺铂发生耐药的机制十分复杂,最重要的原因大致如下:转运蛋白使药物流出、细胞通路受阻、DNA损伤修复能力增高、细胞解毒功能增强等[4,7]。作为关键多能性转录因子之一,Nanog在维持正常胚胎干细胞的自我更新和多能性方面发挥着关键作用[9-11]。最近的数据表明Nanog在多种癌症中表达,并且其表达与癌症患者的不良存活相关[12]。研究表明,Nanog是一种可以赋予癌细胞某些CSC特性的关键因子,例如自我更新,转移和耐药性[13,14],但是Nanog在宫颈癌的顺铂化疗耐受中是否发挥作用及作用机制还是未知的,所以本研究目的是为了探究转录因子Nanog是否在宫颈癌的顺铂化疗耐受中发挥作用及具体的作用机制,为进一步分析Nanog可否成为临床宫颈癌的顺铂耐药的分子治疗靶点提供一定的理论与实验依据。研究方法:1.持续的顺铂梯度加药,建立宫颈癌siha细胞的顺铂耐药株siha/DDP。2.采用CCK-8技术测定不同浓度的顺铂对siha和siha/DDP细胞的生长抑制作用,并计算其半数致死浓度(IC50)和耐药指数(RI)。3.通过实时荧光定量PCR和蛋白印记Western-Blot技术测定siha和siha/DDP中Nanog的表达量。4.通过过表达与沉默宫颈癌siha、hela细胞中Nanog的表达,不同浓度顺铂处理,进行CCK-8实验,计算各组细胞的IC50的值,观察对顺铂敏感性的差异。5.流式细胞仪检测siha、hela细胞沉默Nanog基因后,加入不同浓度顺铂处理后各组细胞的凋亡情况。6.流式细胞仪检测siha、hela细胞过表达/沉默Nanog基因后细胞周期的分布情况。7.Transwell实验检测siha、hela细胞过表达/沉默Nanog基因后不同组的细胞迁移情况。8.Transwell实验检测siha、hela细胞过表达/沉默Nanog基因后不同组的细胞侵袭情况。9.实时荧光定量PCR技术检测各组Nanog及凋亡家族BCL-2、MCL-1、BAD、BAX及多药耐药MDR1表达。10.Western Blot实验检测各组Nanog、pAKT、BCL-2、MCL-1、BAD、MDR1表达。11.通过GraphPad prism7对实验结果进行统计学分析。研究结果:1.建立了siha的顺铂耐药株siha/DDP,CCK-8显示siha、siha/DDP的IC50的值分别为4.97ug/ml、15.96ug/ml。2.实时荧光定量PCR和蛋白印记Western-Blot技术检测后均显示siha细胞中Nanog的表达均低于siha/DDP中Nanog的表达(P<0.05)。3.过表达与沉默宫颈癌siha、hela细胞中Nanog的表达,不同浓度顺铂处理,进行CCK-8实验,观察到过表达Nanog后顺铂对siha、hela细胞的IC50的值都有所增加,同时,当沉默Nanog后,细胞对顺铂的IC50的值降低(P<0.05)。4.siha、hela细胞沉默Nanog的表达,加入不同浓度顺铂处理后发现Nanog沉默组凋亡率高于阴性对照组的凋亡率(P<0.05)。5.流式细胞仪检测到siha、hela细胞过表达Nanog基因后细胞停留在G1/G0期的比例比阴性对照组减少,同时,当沉默Nanog后细胞停留在G1/G0期比例增多(P<0.05)。6.Transwell实验检测到siha、hela细胞过表达Nanog基因后比阴性对照组迁移能力增强,当沉默Nanog的表达时,细胞迁移能力减弱(P<0.05)。7.Transwell实验检测到siha、hela细胞过表达Nanog基因后比阴性对照组侵袭能力增强,当沉默Nanog的表达时,细胞侵袭能力减弱(P<0.01)。8.实时荧光定量PCR技术检测过表达与沉默Nanog后,凋亡家族BCL-2、MCL-1、BAD、BAX及MDR1表达,发现在转录水平上干扰组与阴性对照组之间没有差异(P>0.05)。9.Western Blot实验检测各组Nanog、pAKT、BCL-2、MCL-1、BAD、MDR1表达,发现过表达Nanog组抗凋亡蛋白MCL-1及pAKT的表达也增加,促凋亡蛋白BAD表达减少。但是MRD1及BCL-2表达无变化。同时,沉默Nanog后pAKT及MCL-1表达也降低,BAD表达增加,BCL-2及MDR1蛋白表达仍无变化。研究结论:1.Nanog在siha细胞顺铂耐药的过程中发挥作用,与siha细胞的顺铂耐药有关。2.Nanog的沉默可以增加siha、hela细胞的凋亡率,当Nanog高表达时可以促进细胞的增殖、迁移、侵袭能力。3.当增加Nanog的表达时引起pAKT及下游抗凋亡蛋白MCL-1表达升高,所以我们认为Nanog是通过AKT/PI3K通路,进而影响抗凋亡家族蛋白的表达从而促进宫颈癌细胞对顺铂耐药的。