进化发育生物学(evo-devo)是进化生物学和发育生物学以及遗传学结合的交叉新兴学科。该学科主要研究胚胎发育的起源和进化、发育过程中的修饰如何导致新性状的产生、在进化过程中的发育可塑性、生态通过发育如何影响进化、趋同性和同源性的发育基础等重要问题。果蝇背板DC(Dorsocentral)区域有2对刚毛,家蝇有6对,它们之间数量的差异是研究新性状产生的优秀材料。因此本研究以家蝇和果蝇DC刚毛为模型研究物种间表型进化发育的关系。主要的研究结果如下。(1)通过比对家蝇和果蝇SCUTE、HAIRY、EMC、PNRβ和USH(USH-D)蛋白序列,发现这些蛋白的相似性分别达到42.7%、51.0%、53.1%、69.2%和42.9%。家蝇和果蝇SCUTE和HAIRY基因均编码bHLH功能域,其相似性高达94.9%和100%,EMC编码HLH功能域,相似性为95.5%,PNRβ和USH编码2个锌指结构域,相似性为97.9%和71.4%。这些结果表明家蝇和果蝇调控刚毛发育相关基因的结构非常保守,推测它们在调控刚毛发育时可能具有一定的保守性。(2)构建过表达载体,通过显微注射在果蝇体内过表达家蝇scute、pnrβ、emc和hairy基因,观察表型,研究这些基因的功能。同时与过表达果蝇自身scute、pnrβ、emc和hairy基因的过表达果蝇表型进行对比,研究家蝇和果蝇在一亿年的分支进化过程中这些基因的功能是否发生了演化。结果发现家蝇scute基因能够诱导果蝇产生大量额外的粗刚毛。过表达pnrβ基因时,出现了 4种表型,背板DC区域的粗刚毛数量变化为2、3、4和5根,51%的果蝇背板DC区域粗刚毛出现被抑制的现象。过表达家蝇emc基因后,果蝇表现出背板中间的细刚毛被强烈抑制,具有规律排列的DC粗刚毛也出现不同程度的抑制现象。该结果与过表达果蝇自身emc基因的结果相似。过表达家蝇hairy基因后转基因果蝇背板AC、DC区域的细刚毛被强烈抑制。DC区域的粗刚毛表现出3种表型,这3种表型主要表现在粗刚毛数量的变化,粗刚毛数量分别为0、1和2根。该结果过表达果蝇自身hairy基因的结果相似。从这些结果可以看出家蝇scute、emc和hairy基因与果蝇相似,其功能非常保守,而家蝇基因pnrβ与果蝇相比功能发生演化,需进一步研究。(3)选择亲缘关系更远的物种人类ascl1(scte同源基因)和Id2(emc同源基因)同源基因,通过蛋白序列比对以及在果蝇体内过表达基因ascl1和Id2,研究在8.47亿年的进化过程中scute和emc同源基因的演化情况。结果发现人类ASCL1蛋白与果蝇和家蝇SCUTE蛋白相似性为32.7%,均编码bHLH功能域。人ID2蛋白功能域为HLH,它与果蝇和家蝇的相似性仅有59.5%和61.9%。EMC和ID2 HLH功能域中存在形成异物二聚体的结合位点。EMC和ID2HLH有9个结合位点,但它们仅有4个位点保守。表明人类ascl1和Id2基因在漫长的进化过程中其遗传信息发生了巨大变化,但仍具有保守的功能域。在果蝇体内过表达人类ascl1和Id2,我们发现,ascl1基因诱导果蝇在背板AC和DC区域产生了大量额外的粗刚毛,这一结果与过表达家蝇和果蝇scute基因的结果一致。这个结果表明ascl1基因在漫长的进化过程中功能仍很保守,它仍起着促进粗刚毛生长的作用。过表达人类Id2基因时,果蝇背板中央区域的小刚毛没有发生变化,DC区域的粗刚毛出现被抑制的现象,出现了 2种表型,一种表型为果蝇背板DC区域有2根粗刚毛,另一种表型为DC区域有3根粗刚毛。与过表达家蝇和果蝇emc基因相比,人类Id2基因虽然对刚毛仍起着抑制作用,但其强度被减弱。(4)qRT-PCR方法检测scute、pnr、emc、hairy和ush5个基因在家蝇和果蝇幼虫发育阶段(1st,2nd,3rd1,3rd2,3rd3)mRNA水平的相对表达量,研究两个物种调控刚毛发育相关基因在幼虫发育阶段的表达差异。发现这5个基因的表达量在1st和2nd时期低,进入3rd(3rd2,3rd3)阶段后迅速增加。在3rd阶段,两个物种的表达量存在了一定的差异。果蝇scute、pnr、eme、hairy和ush 5个基因的表达量都在3rd3时期最高,家蝇scute、pnr和emc三个基因的表达量在3rd3时期最高,hairy和ush在3rd2时期最高。观察家蝇和果蝇scute基因的表达规律发现,在3rd阶段,果蝇scute基因的表达量是逐渐升高,家蝇scute基因的表达量在3rd阶段一直是高水平表达。它们表达规律的差异也许是果蝇和家蝇在粗刚毛数量上差异的原因之一。(5)根据qRT-PCR研究结果,选择基因表达量高的三龄时期分离幼虫体内的翅膀成虫盘,同时构建RNA探针,通过RNA原位杂交技术研究家蝇和果蝇scute、pnr、emc、hairy和ush 5个基因的表达模式。结果发现scute、pnr、emc、hairy和ush基因的表达具有物种特异性。果蝇和家蝇scute基因能够特异性的表达于未来会发育成成年果蝇背板的翅膀成虫盘的DC、SC、SA、NP、PS等区域表达。pnr和ush基因表达模式保守,它们均在未来会发育成背板的成虫盘区域强烈表达,其表达范围广,表达水平高。emc基因表达具有物种特异性,家蝇emc基因的表达呈现明显的三条带模式,第一条带推测位于背板上半部,头与前横缝之间的位置;第二条带在背板下半部位置处,前横缝与后横缝之间;第三条带在三角板位置处,由于家蝇在三角板处无刚毛,因此在这一区域能发现大片的emc表达。与家蝇相比,果蝇emc基因的表达模式则没有明显的规律性,它的表达范围更加的广泛,呈现出低水平的表达量。家蝇和果蝇hairy基因表达相似,它们均在相当于成年果蝇三角板区域成虫盘上高水平表达,同时还在背板边缘部位表达,并且有向翅膀区域延伸的趋势。综上所述,本研究结果表明家蝇scute、emc和hairy基因在调控刚毛发育上功能保守,但其基因表达模式具有物种特异性。本研究在分子水平上研究了家蝇调控刚毛发育相关基因的表达模式及功能,通过对家蝇和果蝇幼虫时期基因表达模式的研究,以及成年家蝇和果蝇表型的对比,揭示了在调控表型形成过程中,基因表达模式的演化对表型形成具有重要的调控作用,为进化发育生物学提供了重要的试验和理论依据。