【研究背景与目的】前列腺癌(prostate cancer,PCa)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤,占全球肿瘤发病率第二位、死亡率第六位[1]。我国PCa的发病率近年来一直处于显著的上升趋势。来自北京、上海、广州等发达城市的统计资料显示。在男性泌尿生殖系统的恶性肿瘤中,PCa的发病率已居于首位。流行病学数据显示,中国前列腺癌发病率的增幅巨大,从1993年每10万男性人口1.71例在2005年时已经增加到了每10万男性人口7.9例,平均年增幅高达13%[2]。按照这样的数据计算,在2020年的时候,我国PCa的发病率水平会接近欧美水平,达到每10万男性人口40例!与西方发达国家不同的是,我国前列腺癌发现时分期偏晚,肿瘤已经局部或远处转移,且低分化肿瘤占比高[3]。目前尚无确切分子机制能够阐明前列腺癌转移,也没有相关靶标能够有效地预测前列腺癌转移。因此,关于前列腺癌的转移机制一直是此肿瘤领域研究重点。针对这一问题,从以往的基因转录及蛋白翻译水平均未能深入阐明这些问题,需要通过新的角度来深入探索,以阐明前列腺癌转移的分子机制。基因组学研究表明,哺乳动物基因组仅不到2%转录翻译为蛋白质,超过98%转录为非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)[4]。nc RNA按其分子大小可分为小非编码RNA(small nc RNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)。Lnc RNA被定义为长度超过200nt,不具备编码蛋白的基因转录产物。最初,Lnc RNA被认为不具有生物学功能,仅仅是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物。因为其表达丰度通常较m RNA低,因而被当成转录的“噪音”。但随着研究的进展,人们发现Lnc RNA可以以RNA形式参与基因组印记以及染色质修饰,转录激活,转录后调控,蛋白功能调节等多种重要的调控过程,即使这样,Lnc RNA仍有许多功能尚未被了解。Lnc RNA的失调成为多种肿瘤的特征之一,它与肿瘤的关系成为近年的研究热点,Lnc RNA的出现也为揭示恶性肿瘤的转移特征提供了重要契机[5]。目前已有报道研究Lnc RNA在肿瘤转移中的作用。Lnc RNA-ATB的表达能促进上皮间质转化,促进肿瘤侵袭,并稳定IL-11 m RNA影响肿瘤定植从而促进肝癌细胞的转移[6]。HOTAIR它能同时结合PRC2和LSD1/REST,并介导这2种复合体结合到特异性的基因组位点,抑制相关肿瘤转移抑制基因的表达,促进肿瘤转移[7]。这些研究结果表明,相对于肿瘤相关蛋白质,Lnc RNA可能是更为关键的转移相关因子,这为肿瘤转移的分子机制研究开辟了一个全新的视角。因此,本博士研究课题主要围绕前列腺癌进展相关长链非编码RNA展开,旨在进一步了解Lnc RNAs在前列腺癌转移中所充当的角色,揭示恶性肿瘤转移本质,为前列腺癌的治疗提供新的视角和靶点。我们前期获取66对临床样本前列腺癌患者的组织样本,分别对癌及癌旁组织进行转录组深度测序。在发现癌与癌旁差异表达Lnc RNAs的基础上,进一步对肿瘤进行分层(分化评分,T分期及是否转移)进行生物信息学分析。成功鉴定出17条前列腺癌进展相关的Lnc RNAs。而ENST00000503625(Lnc RNA625)在体外实验中能够明显抑制前列腺癌细胞系的转移表型。第一部分:前列腺癌进展相关长链非编码RNA的筛选和鉴定目的:发现中国人前列腺癌进展相关的关键Lnc RNA,为前列腺癌的治疗提供新的视角和靶点。方法:(1)收集在我院行前列腺癌根治手术的患者的癌及癌旁组织标本66对。(2)送测序公司进行RNA测序。(3)筛选癌及癌旁差异表达的Lnc RNAs。(4)根据患者临床信息进行分层分析,筛选前列腺癌进展相关的Lnc RNAs,确定研究对象。(5)确定目标Lnc RNA在前列腺癌中与临床特征的关系。(6)鉴定Lnc RNA的编码能力,及全长序列。结果:(1)经过患者同意并通过医院伦理委员会批准后,顺利完成临床组织样本的收集。(2)妥善保存的组织送测序公司抽提总RNA后顺利通过质控,完成上机。(3)筛选出癌及癌旁组织差异表达的Lnc RNAs 439条,其中188上调,251下调。(4)进一步分析患者的临床特征,成功鉴定出17条前列腺癌进展相关Lnc RNAs。并辅助应用公共数据库数据分析,确定将ENST00000503625作为研究对象。(6)ENST00000503625与前列腺癌的临床特征相关;(7)通过Coding Potential Calclator(CPC)algorithm计算确认Lnc RNA625没有不具有编码能力。(8)通过RACE实验成功获得Lnc RNA625的全长序列,证实Lnc RNA625与其上游转录EPHA5-AS1实为同一条转录。结论:我们通过大样本的临床样本收集并进行测序,并对测序数据结果进行深度挖掘,同时辅助以生物信息学分析方法,最终通过一系列实验验证了一条全新的Lnc RNA。并经过分析,Lnc RNA625与前列腺癌临床特征关系密切,且与预后相关。运用在线Lnc RNA编码能力计算系统确认其不具有编码能力并用实验方法验证了Lnc RNA625与EPHA5-AS1是同一条转录。第二部分:Lnc RNA625能够抑制前列腺癌细胞的迁移侵袭表型目的:明确特异性筛选出的Lnc RNA625在前列腺中的具体作用。方法:(1)Lnc RNA625的有效干扰RNA筛选。(2)选取高表达Lnc RNA625的细胞系进行下调表达的功能实验。(3)分别用流式细胞仪检测细胞周期、Ed U掺入实验、cck-8实验检测细胞增殖;用Annexin-V/PI双染标记流式细胞仪检测细胞凋亡的变化;Transwell及划痕实验检测细胞迁移及侵袭能力的改变。结果:(1)成功筛选出2条具有较强干扰效率的si RNA,敲除效率在70%以上。(2)明确Lnc RNA625的细胞分布,其中LNCa P、22Rv1为高表达Lnc RNA625的细胞系,确定作为后续实验研究的主要细胞系。(3)敲低Lnc RNA625后能够显著提升细胞的迁移和侵袭能力,然而Lnc RNA625的下调表达对细胞增殖活力及凋亡的影响不显著。结论:Lnc RNA625作为胞浆定位的Lnc RNA能够被si RNA有效的敲除,在细胞系的分布与细胞的恶性程度相关。并且改变Lnc RNA625的表达量能够增强细胞的迁移及侵袭能力,而不影响细胞的增殖及凋亡。第三部分:Lnc RNA625影响抑癌蛋白EPHA5的表达目的:明确Lnc RNA625抑制前列腺癌转移能力的具体分子机制方法:(1)通过序列分析寻找Lnc RNA625的可能靶基因。(2)明确Lnc RNA625与靶基因的变化关系,确认靶基因受到Lnc RNA625的调控。(3)通过Rescue实验验证Lnc RNA625通过靶基因EPHA5发挥作用。(4)探索Lnc RNA625影响靶基因的可能机制。结果:(1)通过序列比对,预测抑癌蛋白EPHA5可能是Lnc RNA625的影响靶点。(2)通过分析组织、细胞中Lnc RNA625与EPHA5蛋白的相关性,及改变Lnc RNA625表达水平后EPHA5蛋白的变化,证实了EPHA5的含量受到Lnc RNA625的调控。(3)通过干扰Lnc RNA625后再过表达EPHA5的Recsue实验证实Lnc RNA625确实通过EPHA5发挥作用。(4)核质分离实验、FISH证实了Lnc RNA625是主要定位细胞质内的长链非编码RNA。(5)通过m RNA半衰期实验说明Lnc RNA625通过保护EPHA5的m RNA而对EPHA5的表达水平起调节作用。结论:Lnc RNA625实为EPHA5 m RNA的反义链,而EPHA5蛋白在是前列腺癌中的抑癌蛋白。通过实验手段,证明了EPHA5是Lnc RNA625的调节靶点。Lnc RNA625通过其5’端的序列与EPHA5 m RNA互补,在细胞浆中保护并延缓EPHA m RNAa的降解,从而影响EPHA5蛋白水平。小结本研究起步于大样本高通量RNA测序数据,围绕前列腺癌进展相关的Lnc RNA展开。通过分析前列腺癌组织与癌旁组织的差异表达,并分类不同的肿瘤分期、分级,发现了在前列腺癌进展过程中下调表达的Lnc RNA ENST00000503625(Lnc RNA625),公共数据分析显示Lnc RNA625是前列腺癌生化复发的独立预测因素。肿瘤的行为学实验研究表明,Lnc RNA625能够对前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力发挥重要的调节作用,而不影响细胞的增殖和凋亡。进一步的机制研究发现,Lnc RNA625能够影响前列腺癌中的抑癌蛋白EPHA5,并用实验方法证实了Lnc RNA625对EPHA5蛋白的调控作用及验证了EPHA5蛋白是Lnc RNA625发挥作用的中间分子。最后证实了Lnc RNA625通过序列互补,在胞浆中延缓了EPHA5m RNA的降解。通过本研究,为前列腺癌的复发转移提供新的监测标志物,为解析前列腺癌转移机制,优化抗肿瘤策略提供新靶点和新策略。