内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是指出生后机体中存在能特异性归巢至血管新生组织并分化成内皮细胞的一群干细胞，包括从成血一血管干细胞到完全分化的内皮细胞之间一定阶段的细胞群体，它不仅参与胚胎时期血管生成，还与损伤的血管内皮的愈合和血管新生密切相关。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，在骨髓中与周围基质细胞紧密接触，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓中动员而出，此后循环内皮祖细胞经过进一步的增殖和分化归巢至外周组织进行损伤的修复。近来的多项研究显示，EPC是参与出生后生理性及病理性血管形成最主要的细胞。因此，内皮祖细胞在心脑血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，具有广阔的应用前景。内皮祖细胞应用于临床治疗主要包括三个领域，包括损伤血管壁的修复、缺血组织新血管形成与再生以及人造血管的包被。限制其临床应用的一个最主要的原因是从骨髓和外周血中分离培养出EPC数量都非常有限，不能满足实验研究及临床应用的需要。解决这个问题的途径包括应用脐带血或脐带组织培养人内皮祖细胞，或者用细胞因子、生长因子、药物来促进人内皮祖细胞动员。因此，对人内皮祖细胞培养方法的研究仍然很有必要。为了培养扩增出大量稳定的内皮祖细胞，本研究参照国内外多家实验室的培养及鉴定方案，在实验中反复摸索，对影响EPC培养扩增的部分重要因素进行比较，通过对人骨髓、脐带血、脐带组织培养内皮祖细胞的比较，以及分别用不同浓度VEGF与EPC共培养研究VEGF对人内皮祖细胞动员的促进作用，进而选择培养获得率高、祖细胞特征稳定以及增殖能力、成血管能力都较强的人内皮祖细胞培养方案，为下一步移植内皮祖细胞用于治疗心血管疾病及多器官功能障碍综合症奠定良好的基础。本实验研究共分三部分：第一部分：不同组织来源的人内皮祖细胞的分离、培养目的：通过对人骨髓、脐带血、脐带组织培养内皮祖细胞的比较，建立起人EPC的标准化分离、培养和扩增的方法，为内皮祖细胞的移植奠定基础。方法：采用密度梯度差速贴壁培养法及组织块植块法，分别从骨髓、脐带血及脐带组织中分离培养内皮祖细胞，按照不同接种密度、换液时间、基础培养液、血清浓度等进行分组，比较原代EPC细胞集落个数及EPC获得率，成熟后EPC通过比较细胞的生长曲线及增殖倍数，利用SPSS统计软件，对相关数据进行总结、分析、比较。结果：通过各种不同培养条件及方法得到的EPC细胞形态基本相似。骨髓来源的人内皮祖细胞在连续传代3代以后，细胞形态即发生明显改变，而脐带血及脐带组织来源的人内皮祖细胞可稳定传代10代以上，细胞形态不发生明显改变。脐带组织及脐带血来源的人内皮祖细胞较骨髓来源的人内皮祖细胞祖细胞形态特征稳定且增殖能力较强。结论：从骨髓、脐带血及脐带组织中能成功分离培养出内皮祖细胞，并能传代扩增。脐带组织及脐带血来源的人内皮祖细胞较骨髓来源的人内皮祖细胞细胞形态特征稳定且增殖能力较强。脐带组织来源的人内皮祖细胞获得率较高且培养方法简便、可靠，可为最终临床应用于防治多器官功能障碍做准备。第二部分内皮祖细胞鉴定与功能检测目的：鉴定培养扩增出的人内皮祖细胞并测定其功能，保证所分离及培养扩增的细胞的性质及纯度。方法：通过采用细胞形态和细胞超微结构观察，用摄取Dil标记的人乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）与FITC标记的特异性荆豆凝集素（FITC-UEA-1）的双色荧光染色法和用CD133、CD34、CD31、KDR等表型表达行免疫组化鉴定EPC及流式细胞仪(FACS)检测EPC纯度以及体外血管生成功能试验进行鉴定，对人骨髓、脐带血、脐带组织培养的人内皮祖细胞进行比较。结果：细胞形态及细胞超微结构符合内皮祖细胞特征，Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双染超过80%，免疫组化、流式细胞仪检测CD133、CD34、CD31、KDR等的阳性率均符合EPC表型特征；体外具有成血管能力。结论：本研究采用综合的鉴定体系（形态特征、流式细胞仪、双色荧光、体外血管生成功能试验）所得结果完全可证明我们培养扩增的细胞为人内皮祖细胞。脐带组织来源的人内皮祖细胞及脐带血来源的人内皮祖细胞与骨髓来源的人内皮祖细胞相比祖细胞特征稳定且成血管能力较强。第三部分VEGF促进脐带组织来源的人内皮祖细胞增殖作用机制的研究目的：研究VEGF促进人脐带组织来源的内皮祖细胞增殖作用机制。方法：比较不同浓度VEGF与人脐带组织来源的内皮祖细胞共培养后内皮祖细胞数量变化及细胞培养液一氧化氮(NO)含量。用PI3K的特异性抑制剂LY294002处理脐带EPCs，同时设空白组和溶剂（DMSO）对照组和10ng/mlVEGF+抑制剂LY294002组，用western blot检测磷酸化Akt蛋白的表达，硝酸还原酶法测定细胞培养液一氧化氮(NO)含量，检测加入抑制剂后细胞增殖能力及成血管能力。结果：10ng/ml浓度的VEGF与人脐带组织来源的内皮祖细胞共培养后内皮祖细胞数量明显增加，细胞培养液一氧化氮(NO)含量明显提高，而20ng/ml浓度的VEGF与人脐带组织来源的内皮祖细胞共培养后内皮祖细胞数量及细胞培养液一氧化氮(NO)含量与10ng/ml浓度相比变化不明显。加入PI3K的特异性抑制剂LY294002抑制PI3K后，磷酸化Akt蛋白表达也明显减少；细胞培养液NO含量明显减少；细胞增殖能力及成血管能力明显下降。结论：10ng/ml的VEGF浓度对人内皮祖细胞的增殖具有明显促进作用，同时培养液中NO浓度明显增高。而20ng/ml浓度的VEGF与10ng/ml浓度的VEGF相比对人内皮祖细胞增殖的促进作用不明显，可能与受体饱和有关。加入PI3K的特异性抑制剂LY294002抑制PI3K后，磷酸化Akt蛋白表达也明显减少；细胞培养液NO含量明显减少；细胞增殖能力及成血管能力明显下降，提示VEGF通过PI3K/Akt/eNOS通路促进人内皮祖细胞的增殖。总之，通过对人骨髓、脐带血、脐带组织培养人内皮祖细胞的比较发现脐带组织及脐带血来源的人内皮祖细胞较骨髓来源的人内皮祖细胞细胞形态及祖细胞特征稳定且脐带组织及脐带血来源的人内皮祖细胞增殖能力及成血管能力均强于骨髓来源的人内皮祖细胞，且脐带组织来源的人内皮祖细胞获得率较高且培养方法简便、可靠。通过分别用不同浓度VEGF与人脐带组织来源的EPC共培养研究VEGF对人内皮祖细胞增殖的促进作用发现10ng/ml的VEGF浓度对人内皮祖细胞的增殖具有明显促进作用，同时培养液中NO浓度明显增高，加入PI3K的特异性抑制剂LY294002抑制PI3K后，磷酸化Akt蛋白表达也明显减少；细胞培养液NO含量明显减少；细胞增殖能力及成血管能力明显下降，提示VEGF通过PI3K/Akt/eNOS通路促进人内皮祖细胞的增殖。这一结论为为下一步研究临床应用移植人内皮祖细胞防治MODS提供确实的细胞学基础并且为下一步研究VEGF促进脐带组织来源的人内皮祖细胞增殖的作用机制打下良好基础。