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第一部分剪切波超声弹性成像技术检测高脂血症诱导勃起功能障碍家兔阴茎海绵体病变作用初探目的:阴茎海绵体的病变在勃起功能障碍（Erectile dysfunction,ED）的发生发展过程中是尤为关键的环节。然而目前临床对于阴茎海绵体病变的评估方法有限,仅能依靠海绵体活检。本研究尝试使用二维剪切波超声弹性成像技术（two-dimensional ShearWave?Elastography,2-D SWE）,探索其对高脂血症诱导的ED家兔阴茎海绵体病变的评估作用。方法和材料:1416周龄雄性新西兰大白兔共12只随机分为2组,每组6只。高脂组（Hyperlipidemia group,HL）给予2%胆固醇+8.5%猪油+7.5%蛋黄粉饲料的高脂喂食,共10周;对照组（Control group,CO）正常饲料喂食。喂养结束后,静脉麻醉下以2-D SWE技术检测所有家兔阴茎海绵体弹性剪切波定量值（shear wave elastic quantitative,SWQ）。检测完毕后测定海绵体内压与平均动脉压比值（intracavernous pressure/mean arterial pressure,ΔICP/MAP）评估勃起功能,免疫组化和Western Blot评估阴茎海绵体平滑肌表型转化和细胞外基质（Extracelluar matrix,ECM）的情况。结果:喂食10周后,HL组较CO组出现明显的高脂血症[总胆固醇（Tc,mmol/L）:33.51±6.17 Vs 1.12±0.27,p<0.01;甘油三酯（Tg,mmol/L）:4.26±2.87 Vs 1.13±0.22,p<0.01;低密度脂蛋白（LDL,mmol/L）:13.51±4.97 Vs 0.60±0.24,p<0.01]。HL组阴茎海绵体SWQ值显著高于CO组（SWQ value（Kpa）:24.53±2.64 Vs 9.97±0.54,p<0.01）,阴茎勃起功能显著低于CO组（ΔICP/MAP:0.17±0.02 Vs 0.40±0.04,p<0.01）。免疫组化及Western Blot证实实验组TGF-β、CollagenⅠ/Ⅲ蛋白表达增高,出现ECM沉积;同时p-MLC20,OPN蛋白表达增高,α-SMA,Calponin-1降低,出现平滑肌细胞由收缩型向合成型的表型转换。结论:高脂血症可造成家兔阴茎海绵体平滑肌ECM沉积并出现由收缩型向合成型的表型转换,最终导致ED。这些病变可影响其SWQ值,并通过2-D SWE技术检测出来。2-D SWE技术有望成为临床上一项全新的无创、简便、准确、可重复的ED诊断和评估方法。第二部分Rho A/Rho激酶信号通路抑制剂法舒地尔长期应用对高脂诱导家兔阴茎海绵体平滑肌病变的作用目的:评估长期应用Rho A/Rho激酶信号通路抑制剂法舒地尔对高脂诱导ED家兔阴茎海绵体平滑肌（Corpus cavernous smooth muscle,CCSM）病变的影响,及对ED的治疗作用。探讨Rho A/Rho激酶信号通路在阴茎CCSM病变过程中的作用机制。方法与材料:1416周龄雄性新西兰大白兔27只,体重1.82.0kg之间,随机分为CO组、HL组及法舒地尔干预组（Fasudil group,FS）,每组9只。HL组与FS组喂食2%胆固醇+8.5%猪油+7.5%蛋黄粉饲料的高脂喂食共10周;CO组予正常饲料喂食。其中FS组自第9周起,给予盐酸法舒地尔注射液1mg/kg,加入100ml生理盐水中,静脉滴注每日一次共2周。3组动物均于第10周末饲养结束,每组各随机抽取3只行阴茎CCSM肌张力测试评估舒张能力。余家兔行阴茎海绵体内压测定评估勃起功能。所有家兔阴茎海绵体标本行免疫组化及Western Blot实验,评估阴茎海绵体Rho A/Rho激酶信号通路活性变化,平滑肌凋亡和表型转化,以及ECM沉积情况。结果:喂食过程中FS组1只家兔猝死,数据剔除。第10周末,HL组（n=9）和FS组（n=8）较CO组（n=9）出现高脂血症。肌张力实验表明,在不同浓度梯度的法舒地尔（0.01、0.1、1、10、100μmol/L）浴液中,离体阴茎CCSM的舒张效应在HL组（n=3）分别为-0.01±0.03%、-0.06±0.05%、-0.04±0.06%、0.16±0.02%、0.45±0.04%;FS组（n=3）分别为0.03±0.04%、0.00±0.00%、0.02±0.05%、0.22±0.04%、0.64±0.08%;CO组（n=3）分别为0.04±0.03%、0.09±0.02%、0.25±0.05%、0.34±0.06%、0.66±0.01%。HL组和FS组阴茎CCSM舒张功能较CO组显著下降,FS组较HL组虽无统计学差异,但在数值上有好转趋势。勃起功能实验HL组（n=6）较CO组（n=6）阴茎海绵体内压显著降低（ΔICP/MAP:0.17±0.02 Vs0.40±0.04,p<0.01）;FS组（n=5）勃起功能恢复,显著高于HL组（ΔICP/MAP:0.31±0.30 Vs 0.17±0.02,p<0.01）。免疫组化和Western Blot显示,各组中Rho A和ROCK-1蛋白含量无显著差异（p>0.05）,但ROCK-2的蛋白含量HL组显著高于CO组（p<0.01）;FS组ROCK-2蛋白含量显著低于HL组（p<0.01）,与CO组无统计学差异。对于细胞凋亡,HL组Caspase-3和PARP蛋白表达显著高于CO组（p<0.01）;FS组较CO组仍升高（p<0.05）,与HL组无统计学差异,但有下降趋势。ECM沉积研究表明,HL组TGF-β蛋白表达、CollagenⅠ/Ⅲ比值显著高于CO组（p<0.01）;FS组TGF-β较CO组无统计学差异。CollagenⅠ/Ⅲ仍高于CO组（p<0.01）,与HL组无统计学差异,但有下降趋势。平滑肌表型转换研究表明HL组OPN蛋白表达量和p-MLC20/MLC20原比值较CO组显著增高,同时Calponin-1和α-SMA蛋白表达含量显著降低（p<0.01）,表明海绵体平滑肌由收缩型转为合成型。FS组较CO组虽仍差异显著（p<0.01）,但与HL组相比改善,差异亦十分显著（p<0.01）。结论:高脂血症可导致家兔阴茎海绵体平滑肌内RhoA/Rho激酶信号通路功能亢进,平滑肌细胞凋亡增加、ECM沉积增加、平滑肌表型由收缩型向合成型转换,表现为平滑肌舒张功能降低,最终引起ED。长期使用Rho A/Rho激酶信号通路抑制剂法舒地尔可以逆转阴茎海绵体的病变,恢复勃起功能。Rho A/Rho激酶信号通路可能在阴茎CCSM的病变中起着重要作用。第三部分Rho A/Rho激酶信号通路对低氧体外培养家兔阴茎海绵体平滑肌细胞自噬的影响目的:低氧能导致阴茎CCSM的病变并最终导致ED。自噬是一种动态的、细胞自我分解的过程,涉及细胞生理活动和病变发生进展的过程。本实验研究观察Rho A/Rho激酶信号通路在低氧诱导家兔阴茎海绵体SMCs（Smooth muscle cell,SMC）自噬过程中的影响和调控机制。材料和方法:6月大性成熟雄性新西兰大白兔,麻醉后取阴茎海绵体,切成组织碎块后以酶消化过筛法进行体外培养。收获原代SMCs后分为5组:1)对照组（Control）在正常氧浓度下培养;2)低氧组（Hypoxia）给予低氧37℃培养（1%O2+5%CO2+94%N2）;其余3组构建质粒对细胞进行转染以调节Rho A/Rho A激酶信号通路活性,转染成功后相同条件低氧培养:3)低氧空载质粒组（Hypoxia/Vector）;4)低氧Rho A过表达组（Hypoxia/Rho A+）;5)低氧Rho A表达抑制组（Hypoxia/Rho A-）。48小时后收获各组细胞,RT-PCR法评估Rho A、Beclin-1,Atg5和Atg7的m RNA表达情况。Western Blot法评估Rho A、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1,Atg5和Atg7的蛋白表达情况。结果:细胞培养及质粒转染结果良好,RT-PCR及Western Blot显示低氧Rho A过表达组Rho A的m RNA及蛋白水平显著高于其余4组（p<0.01）;而低氧Rho A抑制组则显著低于其他4组（p<0.01）。低氧组及低氧空质粒载体组Rho A表达较正常组亦显著升高（p<0.05）。低氧培养的细胞中自噬情况发生了变化:与对照组相比,RT-PCR显示低氧状态下,各组细胞Beclin-1、Atg5和Atg7的m RNA表达均显著增高（p<0.01）。上调Rho A的表达能降低Beclin-1 m RNA的表达（p<0.01）;而抑制Rho A的表达能增加Beclin-1和降低Atg5和Atg7m RNA的表达（p<0.05）。Western Blot实验结果表明与对照组相比,低氧状态下各组细胞Beclin-1、Atg5和Atg7的蛋白表达均显著增高（p<0.01）。Rho A抑制组的LC3Ⅱ/Ⅰ较常氧对照组相近,而其余低氧培养组均显著升高（p<0.01）。上调Rho A的表达能降低Beclin-1和Atg7蛋白的表达（p<0.05）而相对于Rho A过表达组,抑制Rho A的表达能降低LC3Ⅱ/Ⅰ的比例（p<0.01）,同时增加Beclin-1蛋白的表达（p<0.05）。结论:低氧可诱导体外培养的阴茎海绵体的SMCs发生自噬。Rho A/Rho激酶信号通路能影响细胞自噬的程度。本实验为Rho A/Rho激酶信号通路在阴茎SMCs自噬过程中的调节作用以及因此导致ED发生的机制提供了新的证据。