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第一部分小鼠胰岛细胞的分离与纯化【目的】探讨稳定、高效的获得小鼠胰岛细胞的方法,建立小鼠胰岛分离的标准化方案。【方法】BALB/c小鼠采用胆总管内灌注不同浓度胶原酶(0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml)和不同的水浴消化时间(10min、20min、30min),膨胀消化胰腺的方法分离小鼠胰岛,Ficoll-400不连续密度梯度离心法纯化胰岛。纯化出的胰岛细胞在体外采用双硫腙(Dithizone,DTZ)进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,并进行葡萄糖刺激实验测胰岛功能。【结果】不同浓度的胶原酶在不同时间内静止消化胰腺后,收获的胰岛数量有较大的差别,其中采用0.5mg/ml胶原酶Ⅴ,38℃水浴静止消化20分钟组收获量最大为(190±18)个胰岛细胞团,纯度约90%。DTZ染色后胰岛呈腥红色,形态完整。葡萄糖刺激实验,胰岛素能随葡萄糖浓度增加而增加,高糖刺激后胰岛素释放量和低糖刺激后分别为0.535±0.175ng/islet和1.266±0.321ng/islet。【结论】小鼠胰岛分离的过程中胶原酶的灌注、酶的浓度、消化时间、消化温度、小鼠品系、小鼠体重等因素都会对结果产生很大影响。但胶原酶浓度、消化时间和温度是影响小鼠胰岛分离结果的最重要因素,当胶原酶浓度为0.5mg/ml,消化时间20分钟时可获得数量较多,纯度较好的胰岛细胞。第二部分小鼠骨髓来源不成熟树突状细胞的培养和鉴定【目的】研究小鼠骨髓来源不成熟树突状细胞的体外培养方法,为下一步实验奠定基础。【方法】取Babl/c小鼠的后腿骨髓细胞,破红后,体外加入小鼠细胞因子rmGM-CSF和IL-4共培养,采用的细胞因子的终浓度分别为rmGM-CSF 20 ng/ml、IL-4 10ng/ml。在含5% CO2的孵箱中培养48小时后全量换液去除悬浮细胞,加入含有同样浓度细胞因子的完全培养基继续培养,第五天半量换液,第七天收获不贴壁细胞。将收获的细胞用抗小鼠CD11c、MHC-Ⅱ、CD80和CD86流式抗体染色后上流式细胞仪检测,分析结果。【结果】镜下观察:细胞培养48小时后,有很多细胞开始贴壁生长,第一次全量换液去除悬浮细胞后,细胞数量明显减少。培养到第五天,可见细胞有大量增殖,并有很多集落样生长的细胞出现。第七天收获时,集落数量明显减少,同时细胞开始变得疏松,很多细胞开始悬浮生长,集落里的细胞数也明显没有第五天的多,高倍镜下可以看见细胞周围有大量毛刺。流式细胞仪检测:结果显示所得细胞中高表达CD11c,中度表达MHC-Ⅱ、低表达CD80和CD86,其中CD11c阳性的占80%以上,MHC-Ⅱ阳性的约占40%～50%、CD80和CD86阳性的不到总细胞数的10%。说明所得的细胞中树突状细胞的含量很高,纯度超过80%,并且基本为不成熟的树突状细胞。【结论】采用浓度分别为20ng/ml的rmGM-CSF和10ng/ml的IL-4和Babl/c小鼠的骨髓细胞体外共同培养7天的方法可以获得纯度超过80%的树突状细胞,并且基本是不成熟的树突状细胞。第三部分供者抗原特异性Treg细胞的培养和鉴定【目的】研究小鼠抗原特异性Treg细胞的体外扩增方法,并鉴定扩增出来的细胞是否具有抗原特异性。【方法】先用免疫磁珠分选出C57小鼠的脾脏细胞中的CD4~+CD25~+T细胞,然后同Babl/c小鼠的骨髓来源不成熟DC按1:1混合培养,并加入高浓度的小鼠IL-2(2000 U/ml),混合培养7天后收获细胞,取一部分细胞进行流式分析,检测CD4~+CD25~+ Fop3~+细胞的含量。另取一部分进行T细胞增殖抑制试验,试验分两组:实验组:采用CFSE染色过的C57小鼠的CD4~+T细胞、MMC处理过的Babl/c小鼠的成熟DC细胞和扩增出的Treg细胞混合培养;第三方刺激细胞对照组:采用CFSE染色过的C57小鼠的CD4~+T细胞、MMC处理过的昆明小鼠的成熟DC细胞和扩增出的Treg细胞混合培养。通过抑制T细胞增殖能力不同判断扩增出来的Treg细胞是否有抗原特异性。【结果】采用免疫磁珠分选的方法可以分选出纯度超过90%的Treg细胞;使用不成熟DC扩增后的细胞细胞数量明显增加,可以获得纯度在60%以上的CD4~+CD25~+ Fop3~+的Treg细胞。并且T细胞增殖抑制实验中实验组中扩增出的Treg细胞对T细胞的抑制能力明显强于对照组,说明该方法扩增出的Treg细胞具有一定的抗原特异性。【结论】供体来源的不成熟DC细胞在高浓度IL-2存在的情况下,在体外可以大量扩增出具有供体抗原特异性的Treg细胞。第四部分供者抗原特异性Treg细胞诱导小鼠胰岛移植耐受【目的】研究体外扩增获得的抗原特异性Treg细胞能否诱导小鼠胰岛移植耐受。【方法】采用向C57小鼠腹腔内一次注射STZ 200mg/kg的方法先制作出糖尿病小鼠。然后建立从BALB/c小鼠到C57小鼠的胰岛移植模型,观察移植后小鼠血糖情况来判断移植胰岛细胞的存活时间。实验分组:共分三组,第一组(不处理对照组):不给处理,只观察血糖变化;第二组(单纯胰岛移植组):给予胰岛移植,不注射Treg细胞;第三组(实验组):术前1天从静脉给予1×106个供者特异性Treg细胞,然后进行胰岛移植。【结果】15只C57小鼠通过腹腔一次性注射STZ200mg/kg后,按血糖高于16.7mmol/l的标准有12只建模成功,成模率为80%,死亡率为0。胰岛移植后,第一组血糖稳定,观测期间无太大变化;第二组血糖术后1～2天全部恢复正常,到7～11天时陆续开始升高,并维持在术前水平;第三组血糖术后1～2天全部恢复正常,5只分别在第8、19、23、23、31天血糖升高超过16.7mmol/l。【结论】供者抗原特异性Treg细胞可以明显延长移植胰岛的存活时间,在胰岛移植耐受中有积极的作用。