【摘 要】
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目的研究一种传统中药提取物臭椿苦酮对结直肠癌细胞系HCT116和SW620的增殖抑制作用以及相关分子机制。方法1.在含有不同浓度臭椿苦酮的培养基中培养人结直肠癌细胞HCT116、SW620以及人正常肠上皮细胞NCM460。根据CCK8法的检测结果计算不同浓度臭椿苦酮对结直肠癌细胞和正常肠上皮细胞的活力抑制率并绘制活力抑制曲线。同时以5-氟尿嘧啶作为阳性对照,重复上述实验。通过细胞生存曲线我们筛选出
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目的研究一种传统中药提取物臭椿苦酮对结直肠癌细胞系HCT116和SW620的增殖抑制作用以及相关分子机制。方法1.在含有不同浓度臭椿苦酮的培养基中培养人结直肠癌细胞HCT116、SW620以及人正常肠上皮细胞NCM460。根据CCK8法的检测结果计算不同浓度臭椿苦酮对结直肠癌细胞和正常肠上皮细胞的活力抑制率并绘制活力抑制曲线。同时以5-氟尿嘧啶作为阳性对照,重复上述实验。通过细胞生存曲线我们筛选出合适的臭椿苦酮作用浓度及作用时间,并对比了5-氟尿嘧啶和臭椿苦酮的细胞毒性。2.通过克隆形成实验验证臭椿苦酮对结直肠癌细胞的增殖抑制作用,通过划痕实验和Transwell实验验证臭椿苦酮对肿瘤细胞的迁移抑制作用。3.使用Annexin V-FITC/PI染料对细胞进行荧光标记来测定臭椿苦酮和5-氟尿嘧啶作用后结直肠细胞HCT116、SW620凋亡率的变化。使用DNA staining solution染色后使用流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化。4.检测结直肠细胞HCT116和SW620在臭椿苦酮作用前后的线粒体膜电位变化。5.分别提取对照组和实验组的细胞蛋白,并通过Western blot检测细胞周期调控蛋白,Caspase家族和Bcl-2家族等细胞周期调控相关蛋白以及细胞迁移、信号通路相关蛋白。6.使用实时荧光定量PCR仪分析实验组和对照组细胞中JAK和STAT3基因的变化。结果1.CCK8实验表明,臭椿苦酮对结直肠细胞HCT116、SW620有明显的细胞毒性,且呈时间和浓度依赖性。同样的,它对正常肠上皮细胞NCM460也具有细胞毒性作用,但在低浓度组中臭椿苦酮的细胞毒性作用弱于肿瘤细胞。此外,我们以5-氟尿嘧啶作为阳性对照,对比臭椿苦酮和5-氟尿嘧啶对HCT116、SW620细胞系的毒性大小,发现在同样处理24h后臭椿苦酮在两种细胞系中均有着更低的IC50值,在处理48h后臭椿苦酮在SW620细胞系中有着更低的IC50值,其余时间点则无统计学差异。2.臭椿苦酮抑制肿瘤细胞系HCT116、SW620细胞的增殖,降低了肿瘤细胞迁移能力。3.流式细胞仪分析提示臭椿苦酮明显诱导HCT116和SW620细胞凋亡和G2/M期阻滞。在细胞凋亡实验中我们同样以5-氟尿嘧啶作为阳性对照,发现同浓度下（0.4μM）在HCT116和SW620两种细胞系中臭椿苦酮均有着更高的凋亡诱导率。4.实验表明实验组中细胞的线粒体膜电位呈浓度依赖性减低。还发现相较5-氟尿嘧啶臭椿苦酮在HCT116和SW620两种细胞系中更为显著地降低了线粒体膜电位。5.Western-blot实验表明,实验组中两种结直肠细胞中的细胞周期蛋白Cyclin B1以及影响该周期蛋白活性的细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1均被下调。而参与细胞凋亡调控的Caspase家族中的Caspase-9、Caspase-3被剪切激活,促凋亡蛋白Bax和凋亡抑制因子Bcl-2则分别被上调和下调。与肿瘤细胞迁移正相关的蛋白N-cadherin和Vimentin随着臭椿苦酮作用浓度的升高呈下降趋势,而负相关蛋白E-cadherin则呈上升趋势。Cytochrome c在线粒体内减少,而在细胞质中升高。JAK/STAT3信号通路蛋白JAK、STAT3则均被下调。6.RT-q PCR结果提示阳性对照组相较于实验组其JAK、STAT3均被显著下调。结论体外细胞功能实验表明,臭椿苦酮抑制了人结直肠细胞HCT116、SW620的增殖、迁移能力并诱导了HCT116、SW620细胞的凋亡和周期阻滞。更进一步的研究发现臭椿苦酮是通过作用于JAK/STAT3信号通路以及Caspase家族、Bcl-2家族发挥增值抑制、凋亡诱导和周期阻滞的作用。
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