前言：近年来，随着我国人口的老龄化、饮食结构的改变及围产医学水平的提高，视网膜新生血管性疾病发病率呈明显上升趋势，已经成为我国主要致盲眼病之一。视网膜新生血管性疾病主要包括糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等，这类疾病与肿瘤生长、动脉粥样硬化、关节炎等疾病有着共同病理基础--新生血管生成。新生血管生成(angiogenesis)是指从已有的血管(主要是原有的毛细血管和末梢小静脉)的内皮细胞出芽生出新血管的过程。一般来说，在正常生理情况下，微血管管壁的内皮细胞不再进行分裂，只有在女性生理周期或胚胎发育，伤口愈合时，微血管管壁的内皮细胞才会再度生长。但在某些病理(如肿瘤、骨关节炎、眼部缺氧等)情况下，则会发生相关组织新生血管的持续性增生。同肿瘤、骨关节炎等疾病相同，抑制新生血管生成是治疗视网膜新生血管疾病的关键。目前临床对于视网膜新生血管疾病的治疗主要包括视网膜激光光凝、光动力疗法、经瞳孔温热疗法和外科手术干预等。这些方法虽然能够挽救患者部分视力，但是由于它们只是去除了新生血管组织而没有解决病理性新生血管发生的原因，因而大部分患者视力不能恢复到较好水平。病理性新生血管的生成受多种促进因子和抑制因子的调节，有很多途径可以干预新生血管的生成和发展过程。所以，具有抑制新生血管作用的药物是治疗这类疾病的最好选择。　　 近年来相继发现许多新生血管抑制因子，Tumstatin是继angiostatin，endostatin，和PEDF之后最新发现的作用最强内源性新生血管抑制因子。Tumstatin基因来源于血管基底膜Ⅳ胶原a3链，能够通过以非RGD序列结合于整合素αvβ3，然后再通过抑制病灶粘附激酶活性途径、抑制磷脂酰肌醇3激酶活性途径，抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和哺乳动物雷帕酶素靶体活性途径诱导血管内皮细胞的凋亡、抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制新生血管的生成。Tum-5包含tumstatin基因的第54-132个氨基酸，是tumstatin中具有抑制新生血管作用的活性片段，与全长tumstatin具有同等的抑制新生血管形成作用。目前许多在肿瘤领域的研究发现Tusmtatin能够抑制原发肿瘤的生长和转移，但在眼科领域的研究尚未见报道。由于Tumstatin基因强大的抗新生血管作用可能在眼科领域也有广阔的应用前景。　　 由于血眼屏障的存在，全身静脉用药很难把具有抗新生血管生成药物作用到视网膜，而且蛋白半衰期短，往往需要重复注射，反复局部玻璃体腔注射又会带来很多不必要的麻烦和并发症(玻璃体积血、视网膜脱离等)。由于眼球体积小，血.眼屏障能阻止治疗性载体的渗出，其与全身血液循环相独立，使之成为基因治疗良好的靶器官，并且病毒载体能够长时间表达外源性基因，避免了临床抗新生血管药物反复玻璃体腔注射所带来的各种并发症，所以利用病毒载体将具有抑制新生血管作用基因片段转移至眼内达到抑制视网膜新生血管目的的基因治疗是目前治疗视网膜新生血管疾病的研究热点。　　 本研究构建了表达Tumstatin抗新生血管活性片断Tum-5基因的慢病毒表达载体，转染人脐静脉血管内皮细胞，观察其对体外培养脐静脉血管内皮细胞增殖的影响，并将重组慢病毒应用到视网膜新生血管的动物模型中，观察其对视网膜新生血管的抑制作用，为临床视网膜新生血管疾病的基因治疗奠定动物实验基础。　　 方法：　　 一、Tum-5基因的克隆、重组慢病毒GC-FU-Tum5的构建，包装及病毒滴度测定采用PCR技术从含有Tumstatin基因的质粒克隆模板pSPORT1-Sfi钓取Tum-5基因，应用基因重组技术用AgeⅠ和EcoRⅠ分别双酶切pGC-FU和Tum-5基因后定向连接，构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Tum5，通过酶切、测序验证Tum-5基因后，将pGC-FU-Tum5质粒和包装质粒pHelper1.0，pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞，获得携带Tum-5基因重组慢病毒GC-FU-Tum5，利用Real-time PCR检测病毒滴度。　　 二、体外研究：Tum-5基因转移抑制脐静脉血管内皮细胞增殖　　 1、采用MTT法观察Tum-5基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。各组吸光度值以x±s表示，统计结果应用SPSS12.5软件进行分析，多组均数间的比较用One Way-ANVOA。　　 2、TUNEL染色和细胞凋亡Hoechst33258荧光染色形态学上观察慢病毒介导的Turn-5基因诱导的人脐静脉血管内皮细胞的凋亡。　　 3、流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测Tum-5基因诱导的人脐静脉血管内皮细胞的凋亡率4、Western blotting检测Tum-5基因在人脐静脉血管内皮细胞的表达　　 三、动物实验：观察Tum-5基因对视网膜新生血管动物模型视网膜新生血管的抑制作用　　 1、建立氧诱导的视网膜新生血管鼠模型。　　 2、ADP酶染色视网膜铺片观察视网膜血管形态学变化。　　 3、视网膜组织切片观察并计数突破视网膜内界膜血管内皮细胞核。　　 4、应用免疫组织化学对血管内皮细胞特异性免疫细胞化学标志的CD31来识别血管内皮细胞5、Western bloting检测视网膜Tum-5基因的表达。　　 结果：　　 一、成功构建携带Tum-5基因的重组慢病毒pGC-FU-Tum5重组慢病毒pGC-FU-Tum5中携有正确的Tum-5基因，并能在人类细胞中表达；pGC-FU-Tum5和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染包装细胞293T产生重组病毒GC-FU-Tum5；Real-time PCR检测病毒滴度为5×108TU/ml；Westernblotting检测到Tum-5蛋白在靶细胞中持续表达。　　 二、体外研究：Tum-5基因转移抑制脐静脉血管内皮细胞增殖　　 1、采用MTT法观察Tum-5基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响随着体外培养时间的延长，PBS组人脐静脉血管内皮细胞ECV304细胞数目迅速增加；空载体组ECV304细胞的数目与PBS组无明显差异(P>0.05)。MOI为25、50时，作用24、48 h后，转基因组的ECV304细胞数目的增长较PBS组、空载体组缓慢，但是无统计学差异(P>0.05)；作用72 h后，转基因组的ECV304细胞数目显著少于PBS组和空载体组(P<0.01)。　　 2、细胞凋亡的形态学观察　　 (1)TUNEL染色以MOI为25的重组慢病毒GC-FU-Tum5作用于人脐静脉血管内皮细胞ECV304细胞72h后，光学显微镜下观察转基因组大量凋亡细胞，其细胞核体积缩小呈团块状或马蹄形，呈深棕染色，或细胞核中有棕色颗粒。　　 (2)细胞凋亡Hoechst33258荧光染色以MOI为25的重组慢病毒GC-FU-Tum5作用于人脐静脉血管内皮细胞ECV304细胞72h后，荧光倒置显微镜下观察转基因组很多细胞呈强蓝色荧光(凋亡细胞)。　　 3、流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测Tum-5基因诱导的人脐静脉血管内皮细胞的凋亡率。　　 以MOI为25的重组慢病毒GC-FU-Tum5处理ECV304细胞72h后，细胞凋亡率为(26.51±1.54)％；PBS组为(2.90±0.79)％；空载体组为(3.28±0.73)％，转基因组与PBS组、空载体组相比均有显著性差异(P<0.01)。　　 4、Western blotting检测转基因组人脐静脉血管内皮细胞Tum-5基因表达。　　 三、动物实验：Tum-5基因抑制视网膜新生血管动物模型视网膜新生血管生成　　 1、ADP酶染色视网膜铺片观察视网膜新生血管变化基因治疗组17d龄新生鼠ADP酶染色视网膜血管铺片整体情况与正常对照组相似，视盘周围大血管迂曲或扩张情况较给氧对照组、PBS治疗组和空载体治疗都明显改善，自视盘发出的视网膜浅层血管基本呈规则的放射状排列，深层血管网基本正常，其中两只眼有少许新生血管芽，所有铺片均未见明显的无灌注区形成。　　 2、视网膜组织切片观察并计数突破视网膜内界膜血管内皮细胞核基因治疗组17d龄新生鼠视网膜切片突破内界膜血管内皮细胞核数较给氧对照组、PBS治疗组和空载体治疗明显减少(P<0.01)。　　 3、应用免疫组织化学对血管内皮细胞特异性免疫细胞化学标志的CD31来识别血管内皮细胞视网膜组织切片经用CD31抗体处理后，结果显示突破视网膜内界膜玻璃体面的细胞染色阳性，表明这些细胞为内皮细胞，证实它们为血管源性。　　 4、Western bloting检测视网膜Tum-5基因的表达。　　 结论：　　 1、成功构建含有Tum-5基因的重组慢病毒载体。　　 2、体外研究：Tum-5基因转移诱导脐静脉管内皮细胞凋亡，抑制脐静脉血管内皮细胞增殖。　　 3、动物实验：Tum-5基因能够抑制视网膜新生血管动物模型视网膜新生血管的生成。