结直肠癌(colorectal cancer,CRC)也称为大肠癌,是世界第三常见的恶性肿瘤,在男性肿瘤中的发病率为第三位,在女性中的发病率为第二位。每年大约有1,000,000例新发结直肠癌病例被确诊,超过600,000的患者死于该疾病。以外科手术为主的综合治疗是目前针对结直肠癌治疗的主要手段,尽管近年来随着技术的进步和手术方法的改进,使更多原来不能接受根治性手术的病人完成了根治性外科手术治疗,但是仍有约半数的患者在进行根治性切除术后5年内出现疾病的进展。转移一直是结直肠癌患者治疗失败和引起死亡的最常见原因。而在早期发现转移的发生进行及时的治疗可以有效改善患者的预后,而且早期预测转移的发生对于制定治疗策略至关重要。因而寻找早期提示肿瘤转移的特异性的生物标记物,在结直肠癌患者的治疗中起着举足轻重的作用。前梯度同源蛋白2(anterior gradient homolog2, AGR2)是近年来发现的一个与众多腺癌发生、发展相关的基因,在人类的许多腺癌组织中均呈现高表达的状态。目前诸多研究表明,AGR2表达的增高与肿瘤的形成和转移的发生等病理过程密切相关。在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、食管癌等恶性肿瘤的癌组织标本中均检测到AGR2呈现高表达的情况,并且它们的表达水平的增高与患者的不良预后相关。研究发现,AGR2在消化道粘液分泌细胞内也有大量表达,主要分布在肠道粘液分泌细胞的内质网上,可参与肠粘液蛋白MUC2的分泌,在保护肠粘膜屏障的完整性方面发挥着重要的作用。在结肠癌的相关临床研究中发现AGR2是结肠癌循环肿瘤细胞的标记物之一在结肠癌患者外周血中的可以检测到AGR2mRNA的表达,结肠癌患者血清中AGR2mRNA的表达水平与结肠癌浸润等级pT3/T4及更高等级的肿瘤分期相关；同时发现在AGR2mRNA高表达水平的患者,其无病生存期明显降低,即使在肿瘤预后分期处于较早期的结直肠癌患者中也是如此。在对具有相同遗传背景、不同转移潜能的结肠癌细胞株SW480及SW620的差异分泌蛋白质组的研究中发现AGR2是具有差异表达特性的相关蛋白之一。为了进一步研究AGR2基因及其蛋白与结肠癌发生侵袭、转移等恶性生物学行为之间的关系,特设计本研究：首先检测AGR2蛋白在结肠癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,并研究其表达情况与结肠癌患者临床病理特点之间的关系,然后假定AGR2是人结肠癌发生发展的促进因子；它在结肠癌组织中高表达,并与结肠癌的增殖、迁移等恶性行为相关。使用基因干扰的方法下调AGR2mRNA的表达可以有效抑制结肠癌的恶性进展。由此进一步设计实验研究如下：1.研究AGR2在人结肠癌组织、正常结肠组织中的表达情况,并探讨其表达水平与肿瘤临床病理特点如淋巴结转移、肿瘤分化程度等之间的关系。2.设计并筛选有效抑制人结肠癌细胞AGR2表达的si-RNA序列,并构建重组慢病毒AGR2si-RNA (lentivirus-AGR2si-RNA,LV-AGR-2si-RNA)表达载体,并进一步筛选出最有效的抑制AGR2mRNA的si-RNA序列。大量复制后构建慢病毒载体,转染入结肠癌SW620细胞,研究靶向AGR2mRNA的表达后人结肠癌细胞SW620增殖、迁移活性的变化,通过进行MTT实验检测细胞增殖能力的变化,从细胞水平探讨AGR2对结肠癌的生物学行为的影响。并检测抑制AGR mRNA对于侵袭、转移相关因子血管生成调节因子VEGF-A及S100A4mRNA的表达情况的影响,从分子水平探讨AGR2对结肠癌的生物学行为的机制。3.使用免疫组化法检测结肠癌组织病理标本中VEGF-A与S100A4蛋白的表达情况,探讨在临床标本VEGF-A与S100A4的表达情况与结肠癌淋巴结转移、肿瘤侵犯深度之间的关系,并进一步分别研究在结肠癌组织中VEGF-A、S100A4与AGR2表达水平之间的关系。在实验中,我们首先研究了AGR2在人结肠癌组织、正常结肠组织的表达水平及AGR2的表达水平与结肠癌临床病理特点之间的关系。采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法测定人结肠癌组织和正常结肠组织中AGR2蛋白的表达水平,结合临床资料分析AGR2的表达水平与结肠癌临床病理特点之间的关系。发现人结肠癌组织和正常结肠组织中AGR2均有表达,在结肠癌组织中的表达较高,两者之间的差异有统计学意义(P<0.05)。在伴有淋巴结转移的结肠癌组织中,AGR2蛋白的表达较未发生淋巴结转移者明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。在不同浸润程度的结肠癌病灶中,AGR2蛋白的表达随着浸润程度的加深而增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验表明：1.AGR2在人结肠癌组织中的表达显著增高,并且在发生淋巴结转移的结肠癌组织中表达上调。2.随着结肠癌组织浸润程度的加重,AGR2蛋白的表达水平增高。为了研究AGR2在结肠癌细胞中的作用,我们进行了进一步的研究。首先设计了3个针对AGR2靶基因序列的si-RNA序列,分别构建重组si-RNA质粒,小量包装si-RNA慢病毒载体,并转染入人结肠癌细胞系SW620中,通过Q-PCR和Westernblot方法分别测定转染后SW620细胞中AGR2mRNA和蛋白的表达水平,比较基因抑制效果,筛选出有效抑制AGR2mRNA表达的序列。用所筛选出的si-RNA序列,构建重组si-RNA质粒,大量包装LV-AGR2si-RNA,并检测病毒滴度。结果发现：1.Q-PCR检测3个si-RNA序列对AGR2基因的沉默效应,其中以Lv-AGR2si-RNA-1下调最为明显(72%),WB检测结果与其一致。2.选择沉默效应为78%的si-RNA序列包装si-RNA慢病毒载体,测定病毒滴度为4.71*107v.p./ml。通过此阶段试验我们成功构建慢病毒AGR2si-RNA表达载体,可有效下调入结肠癌SW620细胞中AGR2mRNA和蛋白的表达。然后在结肠癌细胞SW620中通过下调AGR2mRNA的表达来研究靶向抑制AGR2的表达对人结肠癌细胞增殖活性的影响；研究靶向抑制AGR2后结肠癌细胞中侵袭转移相关的基因S100A4、VEGF-A mRNA和蛋白表达的变化。具体实验步骤如下：1.根据不同处理因素分别将结肠癌细胞SW620分为3组：实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组加入LV-AGR2si-RNA;阴性对照组加入无关序列慢病毒载体；空白对照组不予任何处理。2.Q-PCR法分别测定各组细胞AGR2mRNA的表达水平。进行细胞活性实验(MTT)检测各组细胞的增殖能力。采用PCR和WB方法分别测定各组细胞侵袭转移相关S100A4与VEGF-A mRNA及蛋白的表达水平。结果发现1.AGR2mRNA的表达水平：Q-PCR结果显示在实验组中AGR2mRNA的相对表达水平低于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而两组对照组之间相比较无显著性差异(P>0.05)。提示实验组细胞LV-AGR2si-RNA对细胞的AGR2基因沉默有效。2.细胞活性实验(MTT)：结果显示实验组细胞生长曲线较平缓,细胞生长速度较阴性对照组和空白对照组显著降低(p<0.05)；阴性对照组细胞生长曲线较空白对照组低平,两组对照组之间相比较无显著性差异(P>0.05)。提示靶向沉默AGR2mRNA的表达可明显抑制结肠癌细胞的增殖活性,同时慢病毒载体本身具有的潜在细胞毒性。3.侵袭转移相关基因S100A4与VEGF-A的mRNA及蛋白表达水平的测定：结果显示在实验组VEGF-A与S100A4mRNA的相对表达水平低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而两组对照组之间相比较无显著性差异(P>0.05)。WB结果与PCR一致,提示抑制AGR2基因的表达后,侵袭、转移相关因子VEGF-A与S100A4表达水平降低。我们发现靶向沉默AGR2mRNA的表达可以抑制结肠癌细胞的增殖活性,同时可以造成与结肠癌细胞侵袭能力有关的S100A4及VEGF-A的mRNA和蛋白表达水平降低。根据细胞实验及分子实验的结果,我们在临床标本中进行了进一步的验证。研究在结肠癌组织中S100A4、VEGF-A的表达情况与AGR2表达之间的关系。采用免疫组织化学方法分别测定该组患者结肠癌组织中S100A4、VEGF-A蛋白的表达水平,分析S100A4及VEGF-A在结肠癌组织中表达的意义,并分析在组织中S100A4、VEGF-A蛋白表达情况与AGR2蛋白表达的关系。发现在结肠癌组织及正常结肠组织中均有S100A4的表达,在出现淋巴结转移的结肠癌组织中S100A4的表达增高；AGR2与S100A4在结肠癌组织中的表达是相关的。VEGF-A并非在所有的结肠组织中均有表达,但在结肠癌组织中均有表达,在浸润深度重的患者中VEGF-A的表达量较高,AGR2与VEGF-A在结肠癌组织中的表达关系尚不明确,仍需进一步大样本研究。组织学中的研究发现：1.在结肠癌组织及正常结肠组织中均有S100A4的表达,S100A4表达增高与淋巴结转移有关,AGR2与S100A4在结肠癌组织中的表达是相关的。2.VEGF-A并非在所有的结肠组织中均有表达,在结肠癌组织中均有表达,在浸润深度重的患者中VEGF-A的表达量较高。