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麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning,PSP)是一种可以与细胞膜离子通道结合阻碍神经传导,引起神经性麻痹的毒素。PSP主要合成于蓝藻,是目前由有害蓝藻引起的中毒事件中最常见的对人体影响较为严重的毒素之一。贝类是海洋中以摄食藻类为主的动物,它们在摄食大量藻类的同时,会对藻中的物质如PSP进行富集,人和动物食用后就会导致PSP中毒,带来严重的经济损失。本文将产PSP藻——微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)首先进行室外培养和PSP的提取,再投喂给我国两广主要的经济贝类——香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)进行人工蓄毒,取其内脏对PSP结合蛋白进行提取,并逐步通过排阻色谱→离子交换色谱→疏水色谱对PSP结合蛋白进行分离纯化,以小鼠生物法(MBA)和液相法(HPLC-FLD)等作为检测手段确定PSP的位置与组成,再通过SDS-PAGE测定其分子量,又对PSP结合蛋白进行HPLC-MS-MS鉴定,并采用生物信息学来分析其构效,最后研究了PSP结合蛋白与PSP之间的吸附动力学。主要结果如下:(1)为准备用于香港牡蛎蓄毒培养的微小亚历山大藻、PSP等样品,本文对微小亚历山大藻进行培养并采用不同破壁方法:超声法、微波法和冻融法对PSP进行提取。不同方法下提取得到的提取液通过MBA和HPLC-FLD检测PSP,并确定采用冻融进行优化试验,得到响应面优化二次回归方程为:Y=193.8+13.75A-35.35B+12.58C-20.2AB+6.95AC-13.35BC-38.75A2-78.05B2-51.70C2。验证实验确定的最佳条件为:冻融3次,解冻温度37℃,pH=7.8,提取液的毒力可达6616±101MU。(2)对香港牡蛎进行PSP蓄毒培养,并对其内脏进行PSP结合蛋白的分离纯化。首先研究不同pH缓冲液对PSP结合蛋白提取的影响,确定在pH=8下进行提取,并通过硫酸铵分级沉淀对PSP结合蛋白进行初步纯化,确定硫酸铵饱和度为40%~70%。然后采用逐步分离:首先进行S-100分离纯化,收集PSP结合蛋白阳性峰;再对S-100收集得到的PSP结合蛋白阳性峰进行Q-FF分离,进行梯度洗脱收集PSP结合蛋白阳性峰;最后对Q-FF收集得到的PSP结合蛋白阳性峰进行RP-HPLC制备。通过SDS-PAGE对分离纯化过程中蛋白组成变化进行监测,得到所提取的PSP结合蛋白的分子量为:33.5kDa。(3)将HPLC-MS-MS用于PSP结合蛋白的鉴定和构效分析:①用DNATSAR分析得出其分子量为36.08kDa。该蛋白共含有335个氨基酸,极性氨基酸和疏水性氨基酸分别占蛋白分子量的38.82%和35.35%,等电点pI=7.25。BLATS分析该蛋白与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的同源性高达78%左右。②利用Predictprotein、NCBI、RPS-BLAST和ConSurf可知其二级结构中α螺旋占28.06%,β折叠占30.75%,无规则卷曲占41.19%。两个结构域为GADPH C端区域家族和GADPH NAD结合区域,活性位点位于具有高保守性的148-155位。③GAPDH与PSP中大量酰胺结构具有较高的亲和性,进一步证明该蛋白为PSP结合蛋白。(4)最后研究了PSP结合蛋白(纯度为:67.47%)对PSP的吸附动力学。单因素试验获得的最佳吸附条件为:pH=9,蛋白浓度3mg/mL,反应时间24h。在此基础上研究了吸附动力学,通过动力学一级和二级方程拟合可知:PSP结合蛋白对PSP的吸附更符合受速度限制的动力学二级方程模型。