【摘 要】
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研究背景和目的胃癌严重威胁全人类生存和健康,其发病率与死亡率均位居所有恶性肿瘤第二位。化疗是胃癌的重要治疗手段,而肿瘤对化疗药物的原发性耐药和继发性耐药严重影响化疗效果,目前肿瘤的耐药机制尚未完全阐明,如何有效逆转化疗耐药仍是世界性难题,临床上仍缺乏有效的干预手段。近年来,长链非编码RNA（Long Noncoding RNAs,lncRNAs）与恶性肿瘤的关系越来越受到重视。本研究旨在通过基因芯
【基金项目】
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国家自然科学基金（81773082;81872423）； 广东省自然科学基金重点项目（2018B030311036）；
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研究背景和目的胃癌严重威胁全人类生存和健康,其发病率与死亡率均位居所有恶性肿瘤第二位。化疗是胃癌的重要治疗手段,而肿瘤对化疗药物的原发性耐药和继发性耐药严重影响化疗效果,目前肿瘤的耐药机制尚未完全阐明,如何有效逆转化疗耐药仍是世界性难题,临床上仍缺乏有效的干预手段。近年来,长链非编码RNA（Long Noncoding RNAs,lncRNAs）与恶性肿瘤的关系越来越受到重视。本研究旨在通过基因芯片筛选胃癌耐药相关的lncRNA,探讨其在胃癌化疗中的功能与机制,以期为胃癌患者化疗耐药的治疗靶点的确立提供新的科学依据。研究方法1通过3D培养模型构建胃癌MGC803奥沙利铂（OXA/R）和5-FU（5-FU/R）耐药细胞株,并通过电镜、western blot及免疫荧光检测耐药细胞与亲代细胞中自噬水平。2通过基因芯片筛选胃癌耐药相关差异lncRNA-CRNDE,CCK8检测其对奥沙利铂和5-FU药物体外敏感性的影响,western blot检测其对自噬和凋亡相关蛋白的影响,裸鼠皮下成瘤实验检测其对奥沙利铂和5-FU药物体内敏感性的影响。3通过生物信息分析CRNDE上游转录因子E2F6,启动子荧光素酶及CHIP实验验证E2F6对CRNDE的转录调控。4利用RNA-pull-down实验联合质谱分析筛选出CRNDE靶基因SRSF6,并通过western blot和RIP实验验证二者的结合。5 Western blot检测CRNDE对SRSF6蛋白表达的影响,以及加入放线菌酮后CRNDE的改变对SRSF6蛋白稳定性的影响。6 CCK8和皮下成瘤实验检测SRSF6对奥沙利铂和5-FU体内外药物敏感性的影响,western blot检测SRSF6对自噬及凋亡相关蛋白的影响。7 CCK8和皮下成瘤实验检测干扰CRNDE后再干扰SRSF6的表达对奥沙利铂和5-FU体内外药物敏感性的影响,western blot检测自噬及凋亡相关蛋白的影响。研究结果:1.OXA/R和5-FU/R细胞株中自噬水平明显高于亲代细胞,自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）可以增加OXA/R和5-FU/R细胞对奥沙利铂和5-FU的敏感性。2.CRNDE在OXA/R和5-FU/R细胞中表达下调,干扰CRNDE增加MGC803细胞自噬,减少凋亡,过表达CRNDE降低OXA/R和5-FU/R细胞自噬,增加凋亡。3.启动子荧光素酶及CHIP实验证实E2F6可以转录水平抑制CRNDE的表达。4.RNA-pull-down、质谱鉴定及RIP实验证实CRNDE可以结合SRSF6蛋白。5.CENDE可以通过降低SRSF6的蛋白稳定性抑制其表达。6.干扰SRSF6可以抑制自噬,增加细胞凋亡,促进化疗增敏。7.干扰CRNDE的表达后再干扰SRSF6的表达,可以逆转CRNDE引起的抑制自噬,促进化疗增敏作用。结论1、CRNDE在胃癌耐药细胞中低表达,可以通过抑制自噬促进凋亡介导奥沙利铂和5-FU化疗增敏;2、E2F6转录抑制CRNDE的表达,而CRNDE又可与SRSF6蛋白结合,降低其蛋白稳定性,从而抑制自噬促进化疗增敏。
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