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在目前肝癌诊疗条件下,只有确诊为早期的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者（30%）可以接受治愈性疗法,而其余的中晚期以及复发的肝癌患者只能进行辅助治疗。现有肝癌辅助治疗手段有限,治疗效果不理想,接受辅助治疗病人的中位生存期（median overall survival,MS）少于6个月,所以,这类病人迫切需要更有效的治疗方法。基于病毒载体的基因治疗已被尝试用于肝脏疾病,并显示出了良好的应用前景。对病毒载体研究已较为透彻,尤其是5型腺病毒（Adenovirus type 5,Ad5）载体。在基因治疗临床试验中,该病毒载体是应用最多的载体类型,并且,5型腺病毒载体的嗜肝特性也使其在肝脏疾病治疗上具有独特的优势。基因治疗药物开发时,选择合适的靶点是决定治疗效果的关键因素之一。多项研究结果显示白介素17A（interleukin-17A,IL-17A）在肝癌进展中发挥了重要作用:肝癌患者肿瘤组织局部IL-17A的高表达与肿瘤进展、治疗效果差及预后不良关系密切;IL-17A能够通过增强肝癌细胞侵袭和迁移能力,增加肝肿瘤局部血管生成来促进肝癌生长。因此,在肝癌组织中阻止IL-17A的合成、促使其降解或封闭其活性将抑制肝癌的进展。基于上述假设以及5型腺病毒载体在基因治疗中的成熟应用,本课题旨在设计并开发以IL-17A为靶点,5型腺病毒为载体的肝癌基因治疗手段,并测试其应用于肝癌基因治疗的可行性及治疗效果。方法:将重组抗体片段的基因序列构建于5型腺病毒载体中,此重组抗体片段需要具备分泌功能、与IL-17A结合的能力并有较好的稳定性;病毒载体在局部给药后可以感染组织中的肿瘤细胞,然后促使重组抗体片段分泌到细胞外,中和肝癌组织局部过盛的IL-17A,达到治疗肝癌的效果。具体实施路径及方法如下:1)调取IL-17A中和抗体的重链可变区（variable regions of heavy chains,VH）和轻链可变区（variable regions of heavy chains,VL）用于重组抗体片段的构建。2)采用基因合成、同源重组、双质粒共转染法、Cs CI梯度超速离心法、壳蛋白免疫法进行载体质粒构建、病毒载体包装、浓缩纯化以及病毒滴度测定。3)采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）进行重组抗体片段的功能评价、稳定性评价及最优片段筛选。4)采用慢病毒感染肝癌细胞系后挑取单克隆的方法筛选得到高表达IL-17A的稳定肝癌细胞株;通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time-PCR,q RT-PCR）以及蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）进行表达检测IL-17A表达。5)采用流式检测法、transwell法、划痕法等进行基于稳定株的病毒载体体外评价。6)采用免疫缺陷小鼠皮下成瘤、免疫组化、小动物活体成像等方法进行病毒载体及重组抗体片段的体内表达、血管生成状况及肿瘤抑制效果评估。实验结果:（1）重组抗体片段设计、腺病毒载体构建及包装。1)本课题设计并合成了4种重组抗体片段,结构分别为sc Fv、sc Fv-sc Fv、sc Fv-CH3和sc Fv-Fc。2)重组抗体片段的基因序列分别插入腺病毒骨架质粒,得到载体质粒pse2784、pse2887、pse2888、pse2889。对插入的基因片段进行酶切鉴定,长度分别为1716 bp、1413bp、1818 bp、1020 bp与理论长度一致;基因测序的结果显示与设计100%一致,以上说明带有重组抗体片段的载体质粒构建成功。3)4种载体质粒分别与包装质粒共转染HEK293细胞进行病毒包装,质粒转染后7-21天内4种病毒载体相继出毒,滴度均在1010 Ifu/ml级别(Ad IL17-s滴度3.16×1010 Ifu/ml,Ad IL17-s C滴度3.93×1010 Ifu/ml,Ad IL17-ss滴度4.11×1010 Ifu/ml,Ad IL17-s F滴度9.48×1010Ifu/ml),满足实验需求。（2）重组抗体片段功能及稳定性检测。1)4种腺病毒载体感染细胞后收集上清,进行以IL-17A为抗原的ELISA检测,结果显示,4种重组抗体片段均具备分泌到细胞外的能力且具备与IL-17A结合的功能,其中Ad IL17-s F抗体效价高于1:1000。2)抗体稳定性检测结果显示,4种重组抗体在反复冻融8次后,Ad IL17-s F、Ad IL17-ss、Ad IL17-s F三组抗体片段与IL-17A依然具备较高结合力(Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s,****P>0.0001;Ad IL17-s C vs.Ad IL17-s,####P>0.0001;Ad IL17-ss vs.Ad IL17-s,????P>0.0001);在与血清37℃共孵育8天后,Ad IL17-s F组抗体片段稳定性高于其他三组(Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s,****P>0.0001;Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s C,####P>0.0001;Ad IL17-s F vs.Ad IL17-ss,?P>0.05)。最终得到结论:Ad IL17-s F组抗体片段sc Fv-Fc具有较好稳定性。（3）腺病毒载体Ad IL17-s F在体外对肝癌细胞功能的影响。1)本课题构建了高表达IL-17A稳定株Hep3B-IL17+和Huh-7-IL17+,在嘌呤霉素筛选及单克隆挑取后,与对照组相比,单克隆稳定株在m RNA水平及蛋白水均有IL-17A稳定表达,表明稳定株构建成功。2)稳定株Hep3B-IL17+和Huh-7-IL17+与对照组相比,细胞侵袭能力增强(Hep3B:IL17+vs.Control,****P<0.0001;Huh-7:IL17+vs.Control,***P<0.001);稳定株的迁移能力也要显著高于对照组细胞(Hep3B:IL17+vs.Control,***P<0.0001;Huh-7:IL17+vs.Control,***P<0.001)。在体外将腺病毒载体Ad IL17-s F作用于稳定株后,稳定株的细胞侵袭能力减弱(Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,**P<0.01;Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,**P<0.01),并且稳定株的迁移也得到抑制(Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,***P<0.001;Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,***P<0.001)。以上结果表明:腺病毒载体Ad IL17-s F能够在体外发挥作用,抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。（4）腺病毒载体Ad IL17-s F体内表达、抑制血管生成及抗肿瘤情况评估。1)活体成像结果显示5型腺病毒载体在瘤内注射后可持续表达32天以上(Ad-LUC vs.Control,****P<0.0001)。2)病毒载体在肿瘤原位注射后,重组抗体片段能够在肿瘤组织中表达(Ad IL17-s F vs.Control,****P<0.0001)。3)与对照组相比,给予Ad IL17-s F治疗后,肿瘤组织内的血管生成被抑制（Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）。4)与对照组相比,Ad IL17-s F治疗组的肿瘤生长受到抑制（Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05;Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）,肿瘤组织内的细胞凋亡增加（Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）。综上所述,本课题首次以IL-17A为靶点,构建了一种5型腺病毒载体Ad IL17-s F,用于肝癌治疗。此腺病毒载体在体外感染细胞后能够表达出重组抗体片段sc Fv-Fc,抗体片段具备IL-17A结合能力,在反复冻融及37℃血清共孵育8天后依然具备良好的稳定性;体外实验中,此病毒载体显示出对肝癌细胞侵袭和迁移的抑制;在体内给予腺病毒载体Ad IL17-s F治疗后,腺病毒载体能够感染肿瘤细胞,表达出抗体片段,抑制肿瘤组织局部的血管生成,并抑制肿瘤生长。本课题证明以IL-17A为靶点治疗肝癌能在一定程度上抑制肝癌生长;由此提供了一种以IL-17A为靶点的基因治疗策略,并证明了其有效性及可行性;这为以细胞因子为靶点的基因治疗方案设计提供了借鉴与新的思路。