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研究背景出血性脑卒中是致残率和死亡率非常高的卒中亚型。脑出血后,脑内的血肿激发一系列的反应导致继发性脑损伤和严重的神经功能障碍。目前研究证实,铁离子介导的氧化损伤和细胞凋亡在脑出血继发性脑损伤机制中起着重要作用。过量的亚铁离子可催化脂质过氧化反应产生大量自由基,继而引起氧化应激性损伤。该损伤常伴有周围组织的水肿,神经炎症以及神经细胞的凋亡。文献报道香芹酚在中枢神经系统疾病中具有重要的神经保护作用。我们的前期研究也发现,香芹酚对小鼠脑出血后的神经功能有一定的保护作用,但其具体机制尚不明确,缺乏研究。因此本课题通过在体外建立铁超载模型,探讨在体外实验中亚铁离子对SH-SY5Y细胞的神经毒性损伤机制,以及香芹酚对此类损伤的影响。进而从SH-SY5Y细胞的角度阐明香芹酚对实验性脑出血后铁超载的神经保护作用及其相应机制。本研究共分三个部分。第一部分:亚铁离子对SH-SY5Y细胞的损伤及香芹酚的保护作用。第二部分:亚铁离子对SH-SY5Y细胞氧化应激和NFκB的活化;第三部分:香芹酚对SH-SY5Y细胞铁超载后NFκB活化的抑制作用及其机制研究。第一部分 亚铁离子对SH-SY5Y细胞的毒性损伤及香芹酚的保护作用目的 构建体外铁超载模型,观察亚铁离子对SH-SY5Y细胞的毒性损伤及香芹酚的保护作用。方法 利用不同浓度梯度亚铁离子刺激SH-SY5Y细胞诱导产生神经毒性损伤。其中部分细胞在香芹酚预处理后接受亚铁离子刺激,用以观察香芹酚对亚铁离子诱导产生毒性损伤的影响。以CCK-8分析检测细胞活性,评估细胞存活率;用TUNEL染色和流式细胞仪分析评估细胞凋亡;同时使用Western blot对凋亡相关蛋白进行测定。结果 亚铁离子对SH-SY5Y细胞的毒性损伤呈浓度依赖性,而香芹酚可明显减轻铁超载引起的细胞毒性损伤。流式细胞检测及Tunel染色结果也显示亚铁离子刺激明显增加SH-SY5Y细胞凋亡,而香芹酚可以减少细胞的凋亡。Western blot结果显示亚铁离子可明显提高促凋亡蛋白Bax,Caspase 3和降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。而香芹酚预处理,可以减少促凋亡蛋白Bax和Caspase 3的表达,同时可以上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论 亚铁离子刺激可以引起SH-SY5Y细胞的毒性损伤,促进凋亡蛋白的表达,进而引起凋亡。而香芹酚可以减轻细胞的毒性损伤,减少凋亡蛋白的表达,从而起到神经保护作用。第二部分亚铁离子对SH-SY5Y细胞氧化应激和NFκB的活化目的 观察SH-SY5Y细胞铁超载后的氧化应激反应,检测亚铁离子刺激对NFκB通路表达变化的影响。方法 SH-SY5Y细胞亚铁离子刺激后,利用荧光探针DCFH-DA对细胞内活性氧进行检测。利用JC-1荧光探针检测细胞内线粒体膜电位的变化。使用realtime PCR技术和Western blot技术检测亚铁离子刺激后NFκB p65的表达变化。同时使用免疫荧光技术对NFKB p65的表达进行细胞定位,检测其核转移现象。行Western blot检测亚铁离子对MAPKs通路中信号蛋白表达的影响。结果 亚铁离子刺激后,荧光强度显示SH-SY5Y细胞内的活性氧含量明显升高,线粒体膜电位降低。而给予香芹酚预处理后,可以减少活性氧的含量,提高线粒体膜电位。RT-PCR和Western blot结果显示亚铁离子刺激诱导NFκB p65的表达呈时间和浓度依赖性。免疫荧光显示亚铁离子刺激促进NFκB p65的核转移。同时,亚铁离子刺激后,磷酸化P38,磷酸化JNK,磷酸化ERK表达均上调。结论 香芹酚可以减轻亚铁离子诱导产生的氧化应激及线粒体膜电位的降低。亚铁离子可以诱导NFκB p65的活化表达和核转移,同时亚铁离子可以使MAPKs通路相关蛋白磷酸化程度升高。第三部分香芹酚对SH-SY5Y细胞铁超载后NFκB活化的影响及其机制研究目的 研究香芹酚预处理对SH-SY5Y细胞铁超载后NFκB活化的影响,探讨其可能的作用机制。方法 SH-SY5Y细胞在香芹酚预处理后接受亚铁离子刺激,利用Western blot或免疫荧光技术检测NFκB p65活化表达及核转移变化.Western blot技术检测香芹酚对IKK蛋白及MAPK相关蛋白活化的影响。应用RT-PCR技术检测相关炎症因子的表达。应用MAPKs通路抑制剂后,行Western blot检测NFκB p65蛋白的表达变化。应用MAPKs通路抑制剂和NFκB p65抑制剂后,行Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3的表达变化。结果 香芹酚可显著抑制亚铁离子诱导的NFκB p65及其下游相关炎症因子（IL-1β,IL-6 and TNF-α）的表达。JNK抑制剂SP600125可以抑制亚铁离子诱导的NFκB p65的表达。同时香芹酚也明显减少IKK和JNK的磷酸化,而对磷酸化P38,磷酸化ERK无明显影响。应用JNK抑制剂和NFκB p65抑制剂均能明显减少亚铁离子诱导的凋亡蛋白Caspase 3的表达。结论 香芹酚对SH-SY5Y细胞铁超载损伤有明显的神经保护作用,其可能机制是通过下调NFκB p65的活化进而减少相关炎症因子释放,最终减少细胞的凋亡。