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植保素是植物受胁迫后产生的具有广谱抗菌活性的小分子次生代谢物,是植物化学防御体系的重要组成部分。在玉米中,目前已经鉴定出三种类型的玉米萜类植保素,其生物合成途径已基本阐述清楚,但是关于玉米萜类植保素的代谢调控机制研究较少。植保素代谢调控主要为生物合成基因的转录调控,解析玉米植保素生物合成基因的转录调控机制对提高玉米抗病性具有重要意义。本课题组前期鉴定了三个调控玉米植保素生物合成的转录因子Zm WRKY79、Zm EREB92和Zm MYC2,但其上游调控机制还不清楚。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联作为关键信号转导元件,利用蛋白磷酸化/去磷酸化周期来传递信息,广泛参与植物次生代谢调控。前期我们通过MAPK级联抑制剂处理玉米,发现植物对禾谷镰刀菌更加感病且植保素生物合成基因表达受到了抑制,推测MAPK级联途径可能参与调控玉米植保素代谢。本研究中,通过体内磷酸化实验发现Zm WRKY79、Zm EREB92和Zm MYC2均能在玉米中被磷酸化;同时克隆了多个玉米MAPK基因,通过酵母双杂交实验、双分子荧光互补和Pull-down实验分析筛选出与三个转录因子互作的Zm MPK3-2,并进一步探究发现Zm MPK3-2参与调控玉米萜类植保素的生物合成。主要研究结果如下:1.磷酸化位点预测发现,Zm MYC2、Zm WRKY79和Zm EREB92这三个转录因子存在多个磷酸化预测位点,并通过体内磷酸化实验发现Zm MYC2、Zm WRKY79和Zm EREB92在玉米体内可以被磷酸化。2.在玉米原生质体分别瞬时过表达Zm MYC2、Zm WRKY79和Zm EREB92,并施加MAPK级联抑制剂处理,结果发现施加MAPK级联抑制剂后,促进了Zm MYC2对下游植保素生物合成基因的激活,抑制了Zm WRKY79对下游基因的正调控,也抑制了Zm EREB92对下游基因An2的正调控。因此MAPK级联途径可能调控转录因子对玉米植保素生物合成基因的激活。3.通过定点突变将部分预测位点突变为不能磷酸化的丙氨酸,并构建了磷酸化位点突变载体。在玉米原生质体分别瞬时过表达Zm MYC2、Zm WRKY79和Zm EREB92的磷酸化位点突变蛋白,发现Zm MYC2磷酸化位点突变后促进了下游关键萜类合酶基因An2和Zm TPS6的表达,Zm WRKY79磷酸化位点突变后抑制了An2和Zm TPS6的表达,而Zm EREB92磷酸化位点突变后抑制了二萜合酶基因An2的表达,Zm TPS6表达无明显变化,表明三个转录因子的磷酸化位点影响了转录因子对下游萜类植保素生物合成基因的调节功能。4.为了筛选参与调控植保素生物合成的MAPK级联组分,以玉米、拟南芥、水稻和番茄中的MAPK蛋白构建了系统进化树,并克隆出玉米中10个MAPK基因。通过酵母双杂交和Pull-down实验分析证明Zm MPK3-2分别与Zm MYC2、Zm WRKY79、Zm EREB92互作,并通过双分子荧光互补实验发现Zm MPK3-2与Zm MYC2、Zm EREB92互作于玉米细胞核。在原生质体中共同过表达Zm MPK3-2和转录因子时发现,Zm MPK3-2能负调控Zm MYC2对下游萜类植保素生物合成基因的调节;Zm MPK3-2正调控Zm WRKY79对下游基因的激活。Zm MPK3-2和Zm EREB92共同过表达不影响对下游An2和Zm TPS6的表达。5.MKK作为MAPK的上游蛋白激酶,为了进一步筛选Zm MPK3-2的上游激酶,在玉米材料中克隆出5个MKK,并通过酵母双杂交和Pull-down实验证明Zm MPK3-2与上游Zm MKK6互作,通过双分子荧光互补实验发现Zm MPK3-2与Zm MKK6互作于玉米原生质体。以上结果表明,玉米中三个参与调控玉米萜类植保素生物合成的转录因子Zm MYC2、Zm WRKY79和Zm EREB92都存在体内磷酸化修饰,并且MAPK级联途径Zm MKK6-Zm MPK3-2位于Zm WRKY79、Zm MYC2和Zm EREB92上游。我们发现Zm MPK3-2通过与Zm MYC2互作,负调控Zm MCY2对下游基因的激活,Zm MPK3-2与Zm WRKY79互作则正调控下游萜类合酶生物合成基因的表达。因此,在玉米遭受外界病原物攻击时,Zm MKK6-Zm MPK3-2级联途径通过对两个转录因子的正负调节,参与调控植保素的生物合成,有利于动态调控植保素代谢,防止植保素的过渡积累,平衡植物生长发育与防御,对研究作物抗性和生长平衡机制具有重要意义。