人参皂苷是人参的主要有效成分,具有多种药理活性,例如:抗炎症、抗过敏、治疗糖尿病和抗氧化等。人参中,糖基化人参皂苷是主要组成部分,而去糖基的稀有人参皂苷含量很低或不存在。相比之下,去糖基化的稀有人参皂苷具有更强地药理活性。因此,稀有人皂苷的制备受到了广泛关注。目前,稀有人参皂苷的制备主要利用酸或碱处理等化学法和微生物或酶催化等生物学方法水解糖链。然而利用化学法水解人参皂苷,会产生副产物和污染环境,无法满足药用标准。因此,以微生物细胞和重组皂苷水解酶为代表的生物转化法被认为是获得稀有人参皂苷最有效的方法之一。以此为契机,本论文以酒曲为载体,挖掘酒曲微生物中转化人参皂苷的功能菌株和皂苷水解酶。本论文主要的研究内容如下:(1)对人参皂苷诱导酒曲进行高通量测序,分析酒曲中潜在的可转化人参皂苷的微生物群落结构与优势类群;同时,对人参皂苷诱导酒曲进行固体发酵,利用TLC检测固体发酵产物进而分析酒曲微生物对人参皂苷的转化能力;(2)采用直接稀释涂板法和固体发酵诱导法从酒曲中分离和鉴定功能菌株;(3)从功能菌株中克隆皂苷水解酶基因,构建pET-30a和pET-32a重组表达载体,并进行原核异源表达和酶学性质表征。本论文主要研究成果如下:(1)通过对人参皂苷诱导酒曲高通量测序和固体发酵,皆证实酒曲微生物具有转化人参皂苷的潜力。通过比较酒曲原样和人参总皂苷底物诱导酒曲的高通量测序结果,发现人参皂苷对酒曲微生物有很强的富集作用,促使酒曲微生物优势物种的更替;(2)利用直接稀释法和固体发酵定向富集分离筛选两种方法,从酒曲中初筛共分离62株具有转化人参皂苷能力的纯培养菌株。经复筛验证29株菌明确可转化人参皂苷,其中12株活性细菌中有6株属于纤维微细菌属(Cellulosimicrobium)微生物。活性真核微生物中,以曲霉、酵母和横梗霉为主;(3)从纤维微细菌属(Cellulosimicrbium)的lyp-41、lyp-51和lyp-57三株菌株中克隆鉴定了5个葡萄糖苷酶基因(Cbgl3、Cbgl7、Cbgl4、Cbgl5和Cbgl8),其中Cbgl3、CbgM和Cbgl5 属于GH1家族,Cbgl7和Cbgl8属于GH3家族。(4)表达并验证Cbgl3、Cbgl7、Cbgl4、Cbgl5和Cbgl8五个重组葡萄糖苷酶,各重组粗酶液均对人参皂苷Rb1都具有转化能力,但仅有Cbg13和Cbg14对人参皂苷Rb2、Rb3、Rc、R1和Re具有转化能力。同时,各重组酶对p-NP-β-D-Glc也具有去葡萄糖基的作用。并对Cbg17和Cbg14进行了纯化和酶学性质表征:最适pH分别为8.5和7.5,最适温度都为40℃。在低于40℃及以下温度,孵育1h,Cbg17和Cbg14酶活无明显变化。在pH 5-9间,4℃孵育1 h,Cbgl7和Cbg14酶活保持不变。两个重组葡萄糖苷酶对乙醇、葡萄糖、大部分实验金属离子和化学试剂都具有一定的耐受性。本论文通过宏基因组测序对酒曲中微生物群落结构及组成进行了解析;以人参皂苷为底物筛选到一批具有转化人参皂苷的微生物,并对其中部分皂苷水解酶基因进行了克隆、异源表达和酶学性质研究,克隆的酶基因表达产物均能转化人参皂苷。本论文对酒曲中安全的微生物资源宝库进行研究,从中挖掘能够转化人参皂苷的功能微生物和皂苷水解酶,不仅丰富了酒曲微生物资源和皂苷水解酶资源库,还为促进人参皂苷催化及其产业的发展提供技术和理论支撑。