目的本实验的目的在于通过水浴模拟肿瘤激光热疗过程中的温度改变,了解不同温度下4T1细胞中干扰素基因刺激因子（Stimulator of IFN genes,STING）以及其下游信号分子干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3,IRF3）含量与磷酸化水平的改变,分析4T1细胞中是否含有完整的STING信号通路;研究肿瘤光热治疗（Photothermal therapy,PTT）对三阴性乳腺癌组织中STING蛋白的影响及其随后续培养时间产生的改变;通过分析温度对4T1细胞中STING信号通路产生的影响,为肿瘤热疗及光热治疗等与STING激动剂的联合应用奠定基础。方法一、在60mm的细胞培养皿中培养4T1三阴性乳腺癌细胞,当细胞在培养皿中贴壁密度达到75%时,于37℃、40℃、42℃、45℃、47℃、50℃的温度下水浴加热30min,随后在37℃5%CO₂恒温恒湿培养箱中培养12h,使用蛋白免疫印迹实验检测细胞中STING蛋白含量与其磷酸化水平、下游信号因子IRF3蛋白与其磷酸化水平改变;当4T1细胞在培养皿中的贴壁密度达到75%时,分别在42℃和45℃温度条件下水浴加热30min,随后分别在37℃5%CO₂培养箱中培养0h、2h、8h、12h,使用蛋白免疫印迹实验检测细胞中STING蛋白与其下游信号因子IRF3蛋白含量改变,并由此分析4T1乳腺癌细胞中的STING蛋白和STING信号通路在不同温度下的改变。二、使用酶联免疫吸附法检测不同温度和时间间隔下4T1乳腺癌细胞分泌的干扰素β（Interferon-β,IFN-β）变化,通过流式细胞术检测不同温度处理后4T1乳腺癌细胞的坏死和凋亡程度,联合STING蛋白及其下游信号因子IRF3的磷酸化水平改变进行分析。三、使用肿瘤激光热疗处理小鼠荷4T1肿瘤模型,激光热疗中使用的光敏剂为吲哚菁绿,使用980nm激光作为光源;分别于接受处理后的第一天、第三天、第七天、第十天处死小鼠取样,将处理后的肿瘤组织进行石蜡包埋,通过免疫组化检测其中STING蛋白含量变化。结果一、在热疗的细胞学实验中,结果显示与对照组相比,随着温度的升高细胞开始回缩变圆、变小,细胞边界模糊,反光增强,在温度升高至一定程度后,4T1乳腺癌细胞不再贴壁,轻敲后全部漂浮在培养基中;我们以温度和处理后培养时间为维度,使用蛋白免疫印迹法检测了水浴加热处理对4T1细胞内STING信号通路关键蛋白的影响,结果显示随着温度的提升,4T1细胞中的STING蛋白和IRF3蛋白水平没有发生明显改变,但是其磷酸化水平都出现了下调;在受到热刺激后,肿瘤细胞内STING蛋白未发生明显改变,IRF3蛋白表达水平下降,但是随着处理后常规培养时间的延长而逐渐恢复。二、酶联免疫吸附测定的结果显示温度的升高对4T1细胞分泌IFN-β的水平没有明显影响。三、在动物学实验中,通过激光热疗处理乳腺癌荷瘤小鼠,在处理后以时间为变量将小鼠处死并取材,使用免疫组化染色观察小鼠接受处理后乳腺癌组织中STING蛋白含量的改变,结果显示,接受激光治疗后的小鼠乳腺癌组织中STING蛋白明显下降,并且随着时间的延长逐渐恢复。结论4T1细胞中含有部分STING信号通路,热效应会下调该通路的激活;4T1细胞中的STING信号通路无法通过分泌IFN-β发挥免疫作用,但是会诱导细胞的凋亡;在细胞学水平,STING蛋白含量不会随热刺激后续培养时间发生改变,但是在动物学水平,乳腺癌肿瘤组织在接受光热治疗或光动力治疗后其中的STING蛋白会大幅下降,并随着处理后时间的延长而逐渐恢复。