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化疗是治疗乳腺癌的重要手段之一,但许多化疗因为肿瘤细胞对化疗药物产生了多药耐药性（MDR）而失败,研究MDR的产生机制对于提高乳腺癌的化疗效果有着重要的临床意义。基因SLC22A18是近年来发现的一个新的候选抑癌基因。该基因编码蛋白与跨膜转运体相似,影响药物敏感性、细胞代谢和生长,可能在乳腺癌MDR的产生中发挥一定作用。SLC22A18基因亦称为IMPT1/BWR1A/TSSC5,属父系印记基因。近年来研究表明,SLC22A18基因表达缺失、突变和印记异常与胚胎性肿瘤及多种实体肿瘤的发生和发展具有相关性,可能在肿瘤发生中发挥抑制作用。SLC22A18基因编码蛋白有十个跨膜区域,显示其与跨膜转运体蛋白具有一定的同源性,可能具有外排化疗药物,从而导致肿瘤细胞产生多药耐药性的功能。跨膜转运体蛋白高表达造成细胞内化疗药物外排增加,从而细胞内药物蓄积浓度降低,此种因素所导致的MDR被称为经典的MDR机制。在经典的MDR机制中,有一大类基因的表达发挥着主要作用,就是ATP结合盒（ATP-binding cassette,ABC）超家族转运蛋白。ABC蛋白的共同点是都具有一个ATP结合盒的结构,能够与ATP结合并水解后者,获得能量将特异性的底物泵出膜外。许多研究证明ABC超家族某些成员在肿瘤,尤其是乳腺癌细胞的多药耐药产生过程中发挥着重要作用,此类被证明具有多药耐药相关性的基因或者蛋白有P-gp、多药耐药相关蛋白1（multi-drugresistance protein 1,MRP1）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP）、肺耐药相关蛋白（lung resistance related protein,LRP）等。SLC22A18与P-gp同属于跨膜转运体蛋白家族,故推测SLC22A18与之相似,亦可能在肿瘤细胞中与多种化疗药物的耐药有关。本研究采用瞬时转染调高MCF-7细胞中SLC22A18基因的表达,通过CCK-8法检测其表达对于MCF-7细胞化疗药物敏感性的影响,并使用流式细胞术研究其表达对于细胞周期以及细胞内阿霉素蓄积浓度的影响。第一部分目的基因的获得及表达载体的构建目的从组织中获取SLC22A18基因全长片段,并构建真核表达载体。方法设计含有酶切位点的引物,通过逆转录PCR从组织中获取全长SLC22A18基因片段,PCR扩增后经过双酶切与表达载体pIRES2-EGFP连接,并由酶切鉴定和测序验证基因片段正确性。结果成功从组织中获得SLC22A18基因全长片段,并构建真核表达载体pIRES2-EGFP-SLC22A18,经酶切鉴定及测序无误。第二部分SLC22A18过表达MCF-7细胞株的建立及鉴定目的建立并鉴定SLC22A18基因表达上调的MCF-7细胞株。方法通过转染感受态细菌扩增表达质粒,紫外分光光度计检测质粒的浓度及质量,通过脂质体法将pIRES2-EGFP-SLC22A18转染MCF-7细胞,倒置荧光显微镜鉴定转染效率,real-time PCR检测SLC22A18基因mRNA表达上调程度。结果质粒扩增获得了浓度及质量较高的质粒溶液;pIRES2-EGFP-SLC22A18质粒转染效率可达40%以上,空质粒转染效率达20%-30%;用real-time PCR方法在两组细胞株中均检测到SLC22A18 mRNA表达,空质粒转染组及重组质粒转染组中SLC22A18mRNA的表达量分别为1.0（0.84-1.19）和26.85（18.38-39.21）,SLC22A18在重组质粒转染组中表达较空质粒转染组上调约26.85倍,显示转染入重组质粒后,SLC22A18基因在MCF-7细胞中的表达明显上升。第三部分SLC22A18过表达对MCF-7细胞多种化疗药物耐药性的影响目的研究SLC22A18过表达对MCF-7细胞阿霉素、紫杉醇、环磷酰胺、米托蒽醌、顺铂耐药性的影响。方法CCK-8法检测转染SLC22A18后乳腺癌细胞株MCF-7的各化疗药物IC50变化;应用SPSS11.5软件进行统计分析。结果过表达SLC22A18的MCF-7细胞与对照组相比,对阿霉素的药物敏感性下降不明显,对紫杉醇,环磷酰胺,米托蒽醌的敏感性均明显下降,对顺铂的敏感性明显上升。SLC22A18转染组细胞较空质粒转染组对阿霉素的IC50由1.82±0.16mg/L上升为2.11±0.30mg/L（P=0.22）,对紫杉醇的IC50由5.38±0.63mg/L上升为7.36±0.89mg/L（P＜0.05）,对环磷酰胺的IC50由1160.80±167.73mg/L上升为1736.73±217.34（P＜0.05）,对米托蒽醌的IC50由5.76±0.52mg/L上升为7.68±0.53mg/L（P＜0.05）;对顺铂的IC50由3.35±0.45mg/L下降为2.08±0.25mg/L（P＜0.05）。第四部分SLC22A18过表达对MCF-7细胞内阿霉素蓄积浓度的影响目的研究SLC22A18过表达对MCF-7细胞内阿霉素蓄积浓度的影响。方法SLC22A18转染组和空质粒转染组细胞分别加入相同浓度的阿霉素,培养相同时间后通过流式细胞仪检测两组MCF-7细胞内阿霉素蓄积浓度的差异;结果SLC22A18转染组和空质粒转染组细胞内阿霉素的平均荧光强度分别为38.31±1.93和44.04±2.60,SLC22A18转染组较空质粒转染组细胞内阿霉素浓度明显下降（P＜0.05）。第五部分SLC22A18过表达对MCF-细胞增殖的影响目的研究SLC22A18表达上调对MCF-7细胞增殖能力的影响。方法通过倒置显微镜观察转染SLC22A18的MCF-7细胞株与空质粒转染细胞株两组细胞的增殖情况、细胞形态等;CCK-8法检测SLC22A18过表达对MCF-7细胞的生长抑制效应;流式细胞术检测SLC22A18过表达对细胞周期变化的影响;应用SPSS11.5软件进行统计分析。结果倒置显微镜下见转染SLC22A18 48h后的MCF-7细胞较空质粒转染组增殖减慢,细胞形态发生改变,生长状态欠佳。转染48h后,SLC22A18转染组吸光度值为0.72±0.02,pIRES2-EGFP转染组吸光度值为0.83±0.04,与空质粒转染组相比较,SLC22A18转染组细胞增殖能力明显下降（P＜0.05）。SLC22A18转染组细胞G0/G1期细胞较空质粒转染组增加（59.71%对56.03%,P＜0.05）;S期细胞较空质粒转染组减少（37.20%对40.30%,P＜0.05）;G2/M期细胞较空质粒转染组减少（3.08%对3.67%,P＜0.05）。提示SLC22A18过表达造成MCF-7发生G1期阻滞,抑制细胞增殖。结论本课题通过构建SLC22A18基因真核表达载体,以脂质体转染的方法调高SLC22A18基因在MCF-7细胞中的表达,研究其过表达对MCF-7细胞生长增殖以及化疗药物耐药性的影响,并进一步研究了其导致多药耐药的机制。研究发现SLC22A18转染组细胞较空质粒转染组增殖能力明显下降;SLC22A18过表达造成MCF-7发生G1期阻滞,抑制细胞增殖;过表达SLC22A18的MCF-7细胞与空质粒组相比,对紫杉醇,环磷酰胺,米托蒽醌的敏感性均明显下降,对顺铂的敏感性明显上升,细胞内阿霉素蓄积浓度明显下降。SLC22A18的耐药性特征与ABC家族成员介导的多药耐药特点相类似,以及其降低阿霉素细胞内蓄积浓度的作用均提示SLC22A18编码蛋白具有跨膜转运蛋白活性,可能是其参与乳腺癌细胞多药耐药性形成的途径之一;而其在提高肿瘤细胞对某些化疗药物耐药性的同时,也发挥着抑制细胞生长增殖的作用,则提示SIC22A18调节肿瘤细胞生长增殖的下游通路可能是某些化疗药物的作用靶点。