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研究目的筛选β甘油磷酸联合L-抗坏血酸和地塞米松诱导的VSMC钙化相关的circRNA、miRNA、mRNA,研究circRNA在促VSMC钙化中的作用和机制。研究方法1.筛选诱导VSMC钙化的最佳浓度:采用不同浓度（0、10、30、50）mmol/Lβ甘油磷酸联合50μg/ml L-抗坏血酸和100 nmol/L地塞米松刺激VSMC 14 d。qPCR检测RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平,Western blot检测RUNX2、BMP4、BMP2的蛋白表达水平。2.筛选VSMC钙化时差异表达的circRNA:将VSMC随机分成对照组、钙化组,钙化组用10 mmol/Lβ甘油磷酸联合50μg/ml L-抗坏血酸和100 nmol/L地塞米松刺激VSMC 14 d。qPCR检测RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平,Western blot检测RUNX2、BMP4、BMP2的蛋白表达水平,茜素红S染色观察VSMC中沉着的钙盐。通过高通量测序的方法筛选钙化组中于对照组表达差异显著的circRNA,琼脂糖凝胶电泳、PCR产物测序验证circRNA的引物序列,qPCR验证表达水平差异最显著且表达稳定的circRNA。3.研究过表达circRNA对血管钙化的调控作用:构建circRNA的过表达质粒然后转染VSMC,将VSMC分为对照组、circ-NC组（转染无关序列）和circ-GALK2组（转染circ-GALK2序列）,qPCR验证转染效率。而后将VSMC分为circ-NC组、circ-GALK2组,转染48 h后更换培养液,用10 mmol/Lβ甘油磷酸联合50μg/ml L-抗坏血酸和100 nmol/L地塞米松刺激VSMC 14 d,qPCR检测RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平,Western blot检测RUNX2、BMP4、BMP2的蛋白表达水平,茜素红S染色观察VSMC中沉着的钙盐。4.circRNA靶向miRNA筛选:使用miRanda软件,预测miRBase数据库中miRNA与差异表达的circRNA的关系,然后用qPCR检测对照组、circ-NC组、circ-GALK2组中miRNA的表达。将VSMC分为miR-134-3p-NC组（转染无关序列）、miR-134-3p-inhibitor组（转染miR-134-3p抑制序列）、miR-134-3p-mimic组（转染miR-134-3p模拟序列）,转染48 h后更换培养液,qPCR检测miR-134-3p的表达。而后分别将VSMC分为miR-134-3p-NC组、miR-134-3p-mimic组、miR-134-3p-inhibitor组和circ-NC组、circ-GALK2组、circ-GALK2+miR-134-3p-mimic组（同时转染circ-GALK2序列和miR-134-3p模拟序列）,48 h后更换新的培养液,继续用10 mmol/Lβ甘油磷酸联合50μg/ml L-抗坏血酸和100nmol/L地塞米松,刺激VSMC 14 d。qPCR检测RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平,Western blot检测RUNX2、BMP4、BMP2的蛋白表达水平。5.miR-134-3p的下游靶基因筛选:利用miRDB和Target Scan数据库筛选miR-134-3p可能作用的靶基因。将VSMC分为miR-134-3p-NC组、miR-134-3p-mimic组、miR-134-3p-inhibitor组,48 h后更换成新的培养液,继续用10 mmol/Lβ甘油磷酸联合50μg/ml L-抗坏血酸和100 nmol/L地塞米松,培养VSMC 14 d后,用Western blot检测CD36的蛋白表达水平。然后将VSMC分为对照组、钙化组,钙化组用10 mmol/Lβ甘油磷酸联合50μg/ml L-抗坏血酸和100nmol/L地塞米松刺激VSMC 14 d,Western blot检测CD36的蛋白表达水平。再将VSMC分为circ-NC组、circ-GALK2组、circ-GALK2+miR-134-3p-mimic组,48 h后弃去旧的的培养液,然后用10 mmol/Lβ甘油磷酸联合50μg/ml L-抗坏血酸和100nmol/L地塞米松,培养VSMC 14 d后,用Western blot检测CD36的蛋白表达水平。研究结果1.建立VSMC钙化模型:qPCR的结果显示,β甘油磷酸浓度为10 mmol/L时,RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平较对照组上调（P<0.05）;Western blot的结果显示,β甘油磷酸浓度为10 mmol/L时,RUNX2、BMP4、BMP2的蛋白表达水平和对照组相比显著上调。因此,选取10 mmol/Lβ甘油磷酸作为最佳处理浓度,进行后续的实验。2.VSMC中候选circRNA的筛选和验证:qPCR的结果表明,钙化组的RUNX2、BMP4、BMP2基因表达水平较对照组上调（P<0.05）;Western blot的结果表明,钙化组RUNX2、BMP4、BMP2的蛋白表达水平和对照组相比上调;茜素红S染色的结果表明,钙化组VSMC的钙盐沉着相比对照组增多。根据高通量测序和差异表达分析结果,在钙化组筛选出46种与对照组表达差异较大的circRNA,钙化组中上调的circRNA有15种,下调的circRNA有31种。随后,从候选circRNA中筛选出表达差异最显著且表达稳定的5种circRNA进行验证。琼脂糖凝胶电泳证实5种circRNA的PCR产物和预期大小相符合。qPCR的结果显示,钙化组VSMC中的circ-GALK2表达上调水平较显著。测序结果显示为circ-GALK2跨接头序列的片段。因此,选取circ-GALK2作为研究对象,探索其对VSMC钙化的调控作用。3.过表达circRNA促进血管钙化:circ-GALK2的过表达质粒,由广州吉赛公司设计和构建。qPCR结果显示,与对照组、circ-NC组相比,circ-GALK2组的circ-GALK2基因表达水平上调（P<0.05）,对照组与circ-NC组circ-GALK2的基因表达水平没有统计学的差异。qPCR结果显示,与circ-NC组相比,circ-GALK2组RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平上调（P<0.05）;Western blot结果显示,与circ-NC组相比,circ-GALK2组RUNX2、BMP4、BMP2的蛋白表达水平上调;茜素红S染色的结果显示,circ-GALK2组VSMC的钙盐沉着相比circ-NC组增多。4.circ-GALK2靶向VSMC中的miR-134-3p:根据生物信息学分析的结果,初步分析5种miRNA,qPCR的结果显示,和对照组、circ-NC组相比较,circ-GALK2组的miR-134-3p基因表达水平下调最显著（P<0.05）。序列分析结果发现circ-GALK2存在miR-134-3p的结合位点。qPCR结果显示,与miR-134-3p-NC组相比,miR-134-3p-inhibitor组的miR-134-3p基因表达水平下调,而miR-134-3p-mimic的miR-134-3p基因表达水平上调（P<0.05）。qPCR结果显示,与miR-134-3p-NC组相比,miR-134-3p-mimic组RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平下调,miR-134-3p-inhibitor组RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平上调（P<0.05）。Western blot的结果显示,和miR-134-3p-NC组相比较,miR-134-3p-mimic组RUNX2、BMP4、BMP2蛋白的表达水平下调,miR-134-3p-inhibitor组RUNX2、BMP4、BMP2蛋白的表达水平上调。qPCR结果显示,与circ-NC组相比,circ-GALK2组RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平上调;与circ-GALK2组相比,circ-GALK2+miR-134-3p-mimic组RUNX2、BMP4、BMP2的基因表达水平下调（P<0.05）。Western blot结果显示,与circ-NC组相比,circ-GALK2组RUNX2、BMP4、BMP2的蛋白表达水平上调;与circ-GALK2组相比,circ-GALK2+miR-134-3p-mimic组RUNX2、BMP4、BMP2蛋白的表达水平下调。5.CD36是miR-134-3p的下游靶基因:CD36基因3,UTR上存在miR-134-3p的结合位点。Western blot结果显示,与miR-134-3p-NC组相比,miR-134-3p-mimic组CD36蛋白的表达水平下调,而miR-134-3p-inhibitor组CD36蛋白的表达水平上调。Western blot结果表明,钙化组CD36的蛋白表达水平较对照组上调。Western blot结果显示,与circ-NC组相比,circ-GALK2组CD36蛋白的表达水平上调;和circ-GALK2组相比较,circ-GALK2+miR-134-3p-mimic组CD36蛋白的表达水平下调。研究结论β甘油磷酸联合L-抗坏血酸和地塞米松诱导的circ-GALK2通过吸附miR-134-3p促进CD36的表达,从而促进VSMC钙化。