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前言腰椎间盘突出(Lumbar disc herniation,LDH)是一种临床常见病,亦有腰椎间盘纤维环破裂症、腰椎间盘脱出症、腰椎软骨板破裂症等称谓。美国骨科医师学会对椎间盘病变作了如下分类:椎间盘正常(椎间盘无退变,所有椎间盘组织均在椎间隙内);椎间盘膨出(纤维环环状均匀性超出椎间隙范围,椎间盘组织没有呈局限性突出);椎间盘突出(椎间盘组织局限性移位超过椎间盘间隙);椎间盘脱出(移位椎间盘组织的直径大于基底连续部,并移向于椎间隙之外)。在该症的发病机制中,人的生理退变是其主导因素,之后才是外伤等原因。因此,在临床法医学鉴定工作中经常涉及LDH的伤、病鉴别以及由此延伸的突出时间的推断问题。鉴定过程中,由于当事人的特殊心理作用,如何准确推断LDH的突出时间显得尤为重要。既往研究显示,CT、MRI等影像学以及电生理学技术都只能作为LDH的诊断指标,而无法准确辨别腰椎间盘生理退变和LDH这一连续过程中的转折点,不能进行LDH发生时间的准确推断。临床上,确诊为LDH的患者,绝大多数都有一些由于腰椎间盘退行性病变导致其结构组成改变,致使髓核突出而产生的腰背痛、放射性痛等症状。关于LDH后如何引起疼痛,一直存在争议。目前主要有自身免疫反应学说和炎症反应学说的发展。1965年,Bobechko等首次提出髓核组织具备自身抗原的基础。这一学说不同于以往用于诊断LDH的影像学、电生理学指标,此论点的关键在于椎间盘纤维环的破裂,髓核组织暴露给机体外周循环系统,产生自身免疫反应。而纤维环破裂恰恰是腰椎间盘退行性病变与LDH的这一连续过程的转折点。本实验通过同种异体椎间盘髓核组织免疫实验动物,制作了LDH髓核暴露给机体循环系统之后,动物体液免疫发生异常的实验模型,进一步验证了LDH的免疫学说,并运用敏感的间接ELISA方法对基础免疫后动物外周血中IgG、IgM的含量进行了测定,探讨推断椎间盘突出时间的新方法。材料与方法一、实验材料(一)实验动物健康成年新西兰大白兔50只(中国医科大学动物实验部提供),雄性,6个月龄,体重2.0-2.5Kg,实验前适应性饲养1周。(二)主要试剂弗氏完全佐剂,弗氏不完全佐剂(中国医科大学免疫教研室提供);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、IgM(购于北京中杉试剂有限公司);小牛血清蛋白(北京博奥森试剂有限公司)。(三)主要实验仪器内切式匀浆机,-70℃低温冰箱;低温高速离心机;洗涤用磁力震荡器;PH检测仪,酶标板。二、实验方法(一)动物分组将实验新西兰大白兔置于自然昼夜规律光照条件下,自由进食、饮水,每笼4只,控制室温于18~20℃。实验动物适应性饲养1周后,称重。随机分为四组:抗原制备组10只;生理盐水对照组10只;佐剂对照组10只;实验组20只。(二)抗原制备处死抗原制备组新西兰大白兔,前路进入,取出各节段椎间盘髓核组织,注意取材过程中勿将血液、肌肉、纤维环等杂质混入。然后将组织4000r/min冰浴匀浆。4℃,6000r/min离心20min,取上清。分光光度计分别测定其A260、A280,运用Lowry-Kalckar公式计算其蛋白质浓度。-70℃分装保存(1.0-2.0ml)。(三)动物免疫动物适应性饲养1周后,取2.0mg/ml抗原20ml与等量弗氏完全佐剂(中国医科大学免疫教研室提供)乳化,对实验组动物进行背部多点基础免疫。此后每隔两周进行一次加强免疫(采用弗氏不完全佐剂,抗原浓度10.0mg/ml),共加强免疫3次。(四)抗血清制备免疫前采血一次所得血清即为每只兔免疫前之对照血清,此后每隔两周于每只新西兰大白兔耳缘静脉采血4.0ml,室温静置1h,4℃过夜,10000r/min,10min,分离血清,于-20℃冰箱分装保存,其余各组分别为不同时段相应的免疫后血清,以抗体效价最佳者做为免疫后血清代表,测定抗体含量。(五)间接ELISA法测血清中IgG、IgM的含量自制抗原包板,然后通过间接ELISA法用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔检测自制抗血清中的抗体含量。(六)统计学方法采用统计学软件SPSS 11.5对数据进行分析。实验结果同种异体椎间盘髓核组织免疫组、自身对照组、佐剂对照组、生理盐水对照组兔血清中IgG的含量分别为0.7566±0.1607(OD450)、0.4936±0.0491(OD450)、0.4690±0.0512(OD450)、0.4339±0.0636(OD450)。其中,免疫组与自身对照组相比,t=7.03,P<0.05,两组数据相比,有显著性差异;免疫组与佐剂对照组以及生理盐水对照组进行方差分析,各组数据均符合正态分布,佐剂对照组与生理盐水对照组相比,P=0.524,>0.05,两组之间无显著性差异;佐剂对照组与生理盐水对照组分别与免疫组相比,P<0.05,有显著性差异。免疫组、自身对照组、佐剂对照组、生理盐水对照组兔血清中IgM的含量分别为0.0745±0.0139(OD450)、0.0441±0.0046(OD450)、0.0438±0.0054(OD450)、0.0426±0.0033(OD450)。免疫组与自身对照组相比,t=9.254,P<0.05,有显著性差异;免疫组与佐剂对照组以及生理盐水对照组进行方差分析,各组数据均符合正态分布,佐剂对照组与生理盐水对照组相比,P=0.794,>0.05,两组之间无显著性差异;佐剂对照组与生理盐水对照组分别与免疫组相比,P<0.05,有显著性差异。结论1、建立了一种新的用来证明LDH体液免疫异常的动物实验方法,证明了髓核组织暴露给机体外周循环系统后,体液免疫产生异常。2、椎间盘髓核组织是一种自身免疫性抗原。3、免疫后动物外周循环中IgG、IgM的含量均有增加。4、通过后续研究,IgG、IgM含量比值的变化规律,可以作为LDH突出时间推断的一个新的指标。