论文部分内容阅读
前言腰椎间盘突出（Lumbar disc herniation，LDH）是一种临床常见病，亦有腰椎间盘纤维环破裂症、腰椎间盘脱出症、腰椎软骨板破裂症等称谓。美国骨科医师学会对椎间盘病变作了如下分类：椎间盘正常（椎间盘无退变，所有椎间盘组织均在椎间隙内）；椎间盘膨出（纤维环环状均匀性超出椎间隙范围，椎间盘组织没有呈局限性突出）；椎间盘突出（椎间盘组织局限性移位超过椎间盘间隙）；椎间盘脱出（移位椎间盘组织的直径大于基底连续部，并移向于椎间隙之外）。在该症的发病机制中，人的生理退变是其主导因素，之后才是外伤等原因。因此，在临床法医学鉴定工作中经常涉及LDH的伤、病鉴别以及由此延伸的突出时间的推断问题。鉴定过程中，由于当事人的特殊心理作用，如何准确推断LDH的突出时间显得尤为重要。既往研究显示，CT、MRI等影像学以及电生理学技术都只能作为LDH的诊断指标，而无法准确辨别腰椎间盘生理退变和LDH这一连续过程中的转折点，不能进行LDH发生时间的准确推断。临床上，确诊为LDH的患者，绝大多数都有一些由于腰椎间盘退行性病变导致其结构组成改变，致使髓核突出而产生的腰背痛、放射性痛等症状。关于LDH后如何引起疼痛，一直存在争议。目前主要有自身免疫反应学说和炎症反应学说的发展。1965年，Bobechko等首次提出髓核组织具备自身抗原的基础。这一学说不同于以往用于诊断LDH的影像学、电生理学指标，此论点的关键在于椎间盘纤维环的破裂，髓核组织暴露给机体外周循环系统，产生自身免疫反应。而纤维环破裂恰恰是腰椎间盘退行性病变与LDH的这一连续过程的转折点。本实验通过同种异体椎间盘髓核组织免疫实验动物，制作了LDH髓核暴露给机体循环系统之后，动物体液免疫发生异常的实验模型，进一步验证了LDH的免疫学说，并运用敏感的间接ELISA方法对基础免疫后动物外周血中IgG、IgM的含量进行了测定，探讨推断椎间盘突出时间的新方法。材料与方法一、实验材料（一）实验动物健康成年新西兰大白兔50只（中国医科大学动物实验部提供），雄性，6个月龄，体重2.0-2.5Kg，实验前适应性饲养1周。（二）主要试剂弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂（中国医科大学免疫教研室提供）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、IgM（购于北京中杉试剂有限公司）；小牛血清蛋白（北京博奥森试剂有限公司）。（三）主要实验仪器内切式匀浆机，-70℃低温冰箱；低温高速离心机；洗涤用磁力震荡器；PH检测仪，酶标板。二、实验方法（一）动物分组将实验新西兰大白兔置于自然昼夜规律光照条件下，自由进食、饮水，每笼4只，控制室温于18～20℃。实验动物适应性饲养1周后，称重。随机分为四组：抗原制备组10只；生理盐水对照组10只；佐剂对照组10只；实验组20只。（二）抗原制备处死抗原制备组新西兰大白兔，前路进入，取出各节段椎间盘髓核组织，注意取材过程中勿将血液、肌肉、纤维环等杂质混入。然后将组织4000r／min冰浴匀浆。4℃，6000r／min离心20min，取上清。分光光度计分别测定其A260、A280，运用Lowry-Kalckar公式计算其蛋白质浓度。-70℃分装保存（1.0-2.0ml）。（三）动物免疫动物适应性饲养1周后，取2.0mg／ml抗原20ml与等量弗氏完全佐剂（中国医科大学免疫教研室提供）乳化，对实验组动物进行背部多点基础免疫。此后每隔两周进行一次加强免疫（采用弗氏不完全佐剂，抗原浓度10.0mg／ml），共加强免疫3次。（四）抗血清制备免疫前采血一次所得血清即为每只兔免疫前之对照血清，此后每隔两周于每只新西兰大白兔耳缘静脉采血4.0ml，室温静置1h，4℃过夜，10000r／min，10min，分离血清，于-20℃冰箱分装保存，其余各组分别为不同时段相应的免疫后血清，以抗体效价最佳者做为免疫后血清代表，测定抗体含量。（五）间接ELISA法测血清中IgG、IgM的含量自制抗原包板，然后通过间接ELISA法用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔检测自制抗血清中的抗体含量。（六）统计学方法采用统计学软件SPSS 11.5对数据进行分析。实验结果同种异体椎间盘髓核组织免疫组、自身对照组、佐剂对照组、生理盐水对照组兔血清中IgG的含量分别为0.7566±0.1607(OD450)、0.4936±0.0491(OD450)、0.4690±0.0512(OD450)、0.4339±0.0636(OD450)。其中，免疫组与自身对照组相比，t=7.03，P＜0.05，两组数据相比，有显著性差异；免疫组与佐剂对照组以及生理盐水对照组进行方差分析，各组数据均符合正态分布，佐剂对照组与生理盐水对照组相比，P=0.524，＞0.05，两组之间无显著性差异；佐剂对照组与生理盐水对照组分别与免疫组相比，P＜0.05，有显著性差异。免疫组、自身对照组、佐剂对照组、生理盐水对照组兔血清中IgM的含量分别为0.0745±0.0139(OD450)、0.0441±0.0046(OD450)、0.0438±0.0054(OD450)、0.0426±0.0033(OD450)。免疫组与自身对照组相比，t=9.254，P＜0.05，有显著性差异；免疫组与佐剂对照组以及生理盐水对照组进行方差分析，各组数据均符合正态分布，佐剂对照组与生理盐水对照组相比，P=0.794，＞0.05，两组之间无显著性差异；佐剂对照组与生理盐水对照组分别与免疫组相比，P＜0.05，有显著性差异。结论1、建立了一种新的用来证明LDH体液免疫异常的动物实验方法，证明了髓核组织暴露给机体外周循环系统后，体液免疫产生异常。2、椎间盘髓核组织是一种自身免疫性抗原。3、免疫后动物外周循环中IgG、IgM的含量均有增加。4、通过后续研究，IgG、IgM含量比值的变化规律，可以作为LDH突出时间推断的一个新的指标。