研究背景与思路胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是一种恶性程度很高的消化道肿瘤,死亡率居世界第四位,在国内恶性肿瘤死亡率中占据第九位。由于胰腺癌具有发病隐匿,进展较快,预后极差,死亡率极高等特点,被称为“癌症之王”。目前,手术切除和化疗是胰腺癌治疗的重要方式和手段,而靶向治疗在胰腺癌中的报道仍然较少。因此,探索胰腺癌的发病机制,寻找胰腺癌的治疗靶点显得尤为重要。前期研究结果表明丝氨酸蛋白酶3(Serine protease 3,PRSS3)作为癌基因,在胰腺癌中高表达。为了探索PRSS3在胰腺癌中潜在的失调机制,本研究在线分析Targetscan和miRanda数据库,发现PRSS3的3’-UTR序列与miR-217互补配对。对PC配对组织和细胞系进行荧光定量PCR分析,发现与癌旁组织和正常胰腺导管上皮细胞相比,胰腺癌组织和细胞中miR-217呈低表达;然后,本研究又对患者的临床资料进行分析,发现miR-217低表达的患者比miR-217高表达的患者生存时间要短,且与肿瘤分期和淋巴结转移相关。细胞功能实验显示,抑制miR-217的表达增加了胰腺癌细胞的恶性表型。众所周知,环状RNA(circRNA)是一类新的明星分子,不同于线性RNA,circRNA是一类没有5’端帽子结构和3’端ployA尾巴的共价闭合环状分子。研究报道circRNA大多数位于真核生物细胞的胞质中,且稳定表达。研究还发现circRNA在肿瘤中具有多种功能,如参与转录调控与剪接,与RNA结合蛋白相互作用,参与翻译,与mRNA竞争性吸附micorRNA等功能。为了寻找与miR-217有关的circRNA,本研究应用starBaseV2.0数据库进行在线预测并通过RNA-pull down实验验证,发现circ-ADAM9与miR-217存在有结合位点。然后,本研究又在胰腺癌组织和细胞系中对circ-ADAM9进行了定量检测,临床预后分析和细胞功能实验等,均验证了 circ-ADAM9参与胰腺癌的发展。进一步的调控研究表明,circ-ADAM9通过海绵吸附miR-217提高PRSS3的表达水平,减弱了 miR-217对PRSS3的抑制作用,从而激活了 ERK/VEGF信号通路。研究结果表明,circ-ADAM9/miR-217/PRSS3的ceRNA调控网络通过调控ERK/VEGF信号通路在PC进展中起关键作用,为胰腺癌的靶向治疗提供了新的思路和方向。材料和方法1胰腺癌患者组织样本、细胞系和临床资料的收集收集郑州大学第一附属医院病理科胰腺癌患者癌与癌旁配对的石蜡组织标本,用离心柱法提取组织样本中的总RNA,并将RNA逆转录为cDNA,cDNA保存-80℃冰箱中备用。从上海中科院购买胰腺癌细胞系和正常胰腺导管上皮细胞系,用Trizol法提取细胞系中的总RNA,将总RNA逆转录为cDNA并保存于-80℃冰箱中备用。收集胰腺癌患者的临床信息,内容包括:住院号、性别、年龄、吸烟史、饮酒史、TNM分期、淋巴结转移、生存时间等。2 miR-217和circ-ADAM9在胰腺癌组织样本、细胞系中的表达水平和临床特征以组织样本cDNA为模板,qRT-PCR技术检测在不同TNM分期和淋巴结有无转移的胰腺癌患者中miR-217和circ-ADAM9的表达水平。以细胞系样本cDNA为模板,qRT-PCR技术检测miR-217和circ-ADAM9在不同细胞系中的表达水平。3 miR-217表达水平增高或降低对胰腺癌细胞系的恶性表型影响从上海吉玛公司购买miR-217的mimics和inhibitors,采用Lip2000脂质体转染法将mimics和inhibitors分别转染到胰腺癌细胞MiaPaca2和Capanl中,转染48h后,qRT-PCR技术检测转染效率;CCK8、迁移、侵袭实验检测miR-217对胰腺癌细胞系的恶性表型影响;Western blot检测胰腺癌细胞系中miR-217的改变对PRSS3、pERK、ERK、VEGF等蛋白表达水平的影响。4 circ-ADAM9表达水平的升高或降低对胰腺癌细胞系的恶性表型影响构建环状RNA过表达质粒pcD-ciR-ADAM9和敲低质粒si-circ-ADAM9,采用脂质体转染法将pcD-ciR-ADAM9和si-circ-ADAM9质粒分别转染到胰腺癌细胞MiaPaca2和Capanl中,48h后,qRT-PCR技术检测转染效率;CCK8、迁移、侵袭实验检测过表达或敲低circ-ADAM9对胰腺癌细胞系的恶性表型影响;Western blot检测胰腺癌细胞系中circ-ADAM9的表达改变对PRSS3、pERK、ERK、VEGF等蛋白表达水平的影响。5胰腺癌细胞系中,PRSS3和circ-ADAM9分别与miR-217的相互作用构建两组双荧光素报告质粒,一组为pmirGLO-PRSS3-3’-UTR-WT和pmirGLO-PRSS3-3’-UTR-Mut,另一组为 pmirGLO-circ-ADAM9-WT/pmirGLO-circ-ADAM9-Mut。将上述两组质粒分别与miR-217和对照模拟物用脂质体Lip-2000的方法共转染到胰腺癌细胞MiaPaca2和Capanl中,48h后,收集细胞,双荧光素报告实验检测相对荧光素酶活性。从上海吉玛公司购买生物素标记的miR-217和对照模拟物,采用脂质体Lip-2000的方法转染miR-217和对照模拟物到胰腺癌细胞MiaPaca2和Capanl中,培养48h 后,RNA pull-down 实验检测 circ-ADAM9,circ-ATAD1,circ-SYPL1,circ-SNF8,circ-ZCCHC14 分别与 miR217 的富集情况。6统计学分析运用统计学软件SPSS22.0对实验结果进行统计分析,数据用均数±标准差表示,组间差异用t检验或卡方检验表示,用Pearson相关系数进行相关性分析,生存曲线采用Kaplan-Meier图和长秩检验来分析,采用GraphPad 7.0软件做图。*p<0.05,**p<0.01 和***p<0.001.结果1胰腺癌中,miR-217是PRSS3潜在的上游负调控基因双荧光素酶报告实验结果显示PRSS3的3’-UTR区与miR-217互补配对。与癌旁组织相比,荧光定量PCR结果显示miR-217在胰腺癌组织中呈低表达;结合临床资料分析,发现TNM分期越高和有淋巴结转移的患者miR-217的表达水平较低;生存分析发现,随着生存时间的延长,miR-217低表达患者的存活率越低。2 miR-217通过靶向PRSS3抑制胰腺癌细胞的恶性表型荧光定量PCR和Western blot结果显示,下调miR-217,则PRSS3的mRNA和蛋白表达水平均升高;而过表达miR-217,PRSS3的mRNA和蛋白表达水平则均降低。下调miR-217,细胞功能实验结果显示胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均提高;然而,同时下调PRSS3,可以挽救下调miR-217引起的胰腺癌细胞的恶性表型;相反,同时过表达miR-217和PRSS3,胰腺癌细胞的恶性表型也被相互抑制。3胰腺癌细胞系中,circ-ADAM9充当海绵吸附miR-217双荧光素酶报告实验结果显示miR-217与circ-ADAM9互补配对;RNA pull-down实验结果证实,circ-ADAM9可以富集miR-217。4 circ-ADAM9在胰腺癌组织样本中的表达水平和临床特征与癌旁组织相比,荧光定量PCR结果显示circ-ADAM9在胰腺癌组织中呈高表达;结合临床资料分析,发现TNM分期越高和有淋巴结转移的患者其circ-ADAM9的表达水平较高;生存分析发现,随着生存时间的延长,circ-ADAM9高表达患者的存活率越低。5 circ-ADAM9/miR-217/PRSS3轴在胰腺癌细胞系中的机制研究过表达circ-ADAM9,荧光定量PCR和Western blot结果显示,PRSS3的mRNA和蛋白表达水平均升高,pERK、VEGF的蛋白表达水平也升高;下调circ-ADAM9,则PRSS3的mRNA和蛋白表达水平均降低,pERK、VEGF的蛋白表达水平也降低。同时过表达circ-ADAM9和抑制PRSS3,细胞功能实验结果显示胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均被相互抑制。结论1、PRSS3 由 circ-ADAM9/miR-217 信号轴调控;2、circ-ADAM9/miR-217/PRSS3 的 ceRNA 调控网络通过调控 ERK/VEGF信号通路在PC的发生发展中起着至关重要的作用。