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研究背景:随着现代工作和生活节奏的不断加快,胃动力障碍发病率明显增高。胃的运动功能即胃排空是消化系统最主要的生理功能之一,正常的胃排空不仅能够传送食糜,而且推动胃内细菌及其产物的排出,对消化系统具有非特异性的免疫防御作用。新近流行病调查数据显示,成年女性较同龄男性更易胃排空延迟,而在整个生理周期里,黄体期(高浓度雌激素水平),胃排空时间延长最明显。临床上雌激素替代治疗,造成血清雌激素浓度高于生理水平,患者也会表现出早饱、恶心、呕吐、腹痛、腹胀等胃排空抑制症状。影响胃排空的因素很多,机制复杂,其中,胃平滑肌收缩是影响胃排空的直接环节,而Rho/Rock2信号通路具有调控细胞收缩的生物学效应,雌激素可通过平滑肌上的雌激素受体(Estrogen receptor,ER)或机体雌激素代谢产物等非受体途径干预信号通路。中医药以脾胃学说为理论指导,诊疗胃排空延迟,经验丰富、副作用小,极具研究价值和应用前景。值得注意的是,在诸如五指毛桃、无花果、北沙参、补骨脂以及四数九里香等健脾益胃的中药里均含有少量拟雌激素药物成分-补骨脂素,其化学结构与雌二醇(17 β-Estradiol,E2)类似,都具有杂环酚羟基,还能够与ER进行分子拟合,具有雌激素样生物功能,是干预胃排空的潜能中药单体,当补骨脂素达到一定剂量时,可能会造成胃排空延迟。因此本课题将在生理状态和E2替代造成的病理状态下,展开E2及补骨脂素抑制胃排空的浓度和机制探讨,为临床用药提供剂量参考和实验依据。目的:生理状态下,验证E2抑制胃排空的浓度相关性;探讨其作用机制是否为ER介导Rho/Rock2信号通路抑制胃平滑肌收缩,在此基础上,研究E2替代造成胃排空抑制,这一病理状态下的E2浓度相关性,以及雌激素代谢对Rho/Rock2信号通路的影响;最后对比外源性E2,明确补骨脂素干预胃排空的剂量、时间及对雌激素代谢的影响效应。方法:1.生理状态下,验证E2抑制胃排空的浓度相关性。采用亚甲蓝染色制备阴道上皮涂片,鉴定SD(Sprague Dawley,SD)雌性大鼠的动情期和间情期,选取生理周期规律的大鼠,用于后续实验,并随机分组(n=10)。因间情期与动情期,雌性大鼠体内血清E2水平差异最大,采用放射性免疫分析方法分别检测动情期和间情期大鼠血清的E2水平值。分别对间情期及动情期大鼠灌胃0.6g固体营养糊,4小时后依照公式胃排空率(%)=1-(胃全重-胃净重)/胃内容物原重X 100%计算出胃排空率。2.体外细胞实验,验证E2抑制胃排空的作用靶标是否为其平滑肌细胞。取SD乳鼠提取并分离出胃的原代平滑肌细胞,进行鉴定,体外培养3-4代胃平滑肌细胞,分组如下:1)空白组、2)ACH 组(Acetylcholinesterase)、3)ACH+E2 组、4)ACH+E2+ATM(Tamoxifen)组。各组细胞都培养在无酚红的培养基中,按实验方案分别给予ACH,E2,ATM,培养1h后加入2.5%戊二醛细胞固定液,应用电子显微镜(10×40倍)中的测微尺,随机观察并记录50个完整的胃平滑肌细胞长度,按照细胞长度测算公式,计算出各组细胞的平均长度。3.生理状态下,验证E2干预胃平滑肌收缩是否由ER介导调控Rho/Rock2信号通路。采用免疫蛋白印迹、免疫组化和荧光等技术,首先测定间情期及动情期大鼠胃平滑肌的雌激素受体(ER α/ER β)和收缩蛋白Rock2的表达情况,并具体到胃底、胃体和胃窦等不同部位,接着测定通路下游收缩效应蛋白Rock2、F-actin及Visculin的表达变化;最后应用雌激素受体抑制剂ICI182,780和Rho/Rock2信号通路抑制剂Y-27632反向验证。4.病理状态下,E2抑制胃排空的浓度相关性,及其对雌激素代谢及胃平滑肌Rho/Rock2信号通路的干预研究。对成年雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术后(Ovariectomy,0VX),连续5天腹腔注射青霉素预防感染,并继续恢复一周,辅以阴道上皮角化实验判定去势的成功与否,建立不同浓度E2干预组(0.05mg/kg、0.2mg/kg、0.8mg/kg),以去势大鼠为参比,检测血清E2、胃排空率、ER以及Rock2蛋白表达等指标。考虑到E2代谢产物的影响,进一步应用雌激素代谢酶P450阻断剂1-氨基苯并三唑(1-aminobenzotriazole,ABT)和雌激素受体抑制剂ICI182,780,检测外源E2干预后大鼠的ROS、MDA含量,以及ER与Rock2蛋白的表达。5.补骨脂素干预胃排空的剂量和时间效应研究。大鼠行双侧卵巢切除术(OVX)后,分别灌胃0.8mg/kg的E2和不同剂量补骨脂素(P-H:8mg/kg;P-M:4mg/kg;P-L:2mg/kg),按照给药一周、两周、三周、四周,观察血清E2水平、胃排空率,ROS及MDA的含量,Rock2表达量,并记录大鼠的体重变化。结果:1.阴道上皮角化实验成功地辨别了雌性SD大鼠的生理周期。动情前期阴道涂片中可见大量收缩成椭圆形的有核上皮细胞,白细胞和角质化上皮细胞很少;动情期,镜下大量无核的不规则片状角化上皮细胞占绝对数量;发情后期,片状角质化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞3种细胞均可见,并且比例无明显差异;而间情期则表现为大量的白细胞,极少量的有核上皮细胞。间情期E2水平较动情期低,具有统计学意义(P<0.05)。灌胃4h后,间情期大鼠胃排空率达79.70±12.47(n=8),而动情期的胃排空率是49.33±11.24(n=7),间情期胃排空率明显高于动情期,并有统计学差异(P<0.05)。2.分离并鉴定了大鼠胃平滑肌细胞,以10-8M ACH诱导平滑肌细胞收缩作为阳性对照组,探索不同浓度(10-4/10-3/10-2/10-1M)E2对平滑肌细胞的长度改变,其中10-2/10-1浓度E2能够明显抑制ACH诱导的细胞收缩(P<0.05),而且这种抑制作用能够被TAM所阻止(P<0.05)。3.检测间情期及动情期大鼠胃部ER的表达,发现胃部平滑肌以雌激素受体α为主要亚型表达,且动情期ERα的表达显著高于间情期(P<0.05);进一步具体到胃窦部ER α与Rock2表达呈负相关,并具有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光显示间情期Visculin在细胞内呈聚集表达,而动情期则相对弥散。进行图像重合后,间情期的胃窦平滑肌细胞内Visculin及F-actin聚集明显,能够清晰地展示出平滑肌条索样细胞形态和走向,而动情期则比较模糊,不见平滑肌细胞条索形态。4.与动情期组结果一致,Rho/Rock2信号通路抑制剂Y-27632可以降低大鼠收缩蛋白Rock2、F-actin及Visculin相关蛋白的表达,但对ER α无影响。当给予雌激素受体抑制剂ICI182,780干预后,能够明显抑制ER α表达、增加Rock2以及F-actin的表达量(P<0.05)),并使Visculin具有上升的表达趋势。5.SD雌性大鼠行双侧卵巢切除术(OVX)后,给予不同剂量外源性E2,其中E20.05组与OVX组大鼠血清E2水平无统计差异,而E2 0.2组、E2 0.8组的血清E2水平显著高于OVX组(P<0.05);此时,E2 0.2组、E2 0.8组胃排空率较OVX组降低(P<0.05);E2 0.2 组、E2 0.8 组的 ER α 表达较 OVX 组高(P<0.05),然而其 Rock2表达却比OVX组减少,并伴随高含量的ROS以及MDA(P<0.05),而这种ROS及MDA的高分泌可被雌激素代谢酶广谱抑制剂1-氨基苯并三唑(1-aminobenzotriazole,ABT)所抑制(P<0.05)。与外源性E2干预组比较,雌激素受体抑制剂ICI.182,780均能抑制各剂量E2干预组ER α的表达(P<0.05),ABT虽然轻度降低了 ER α的表达,但组间差异无影响;而ABT却能使E2 0.2组、E2 0.8组抑制的Rock2反弹性高表达(P<0.05),而受体抑制剂ICI182,780却对E2 0.2组、E2 0.8组造成的Rock2的低表达无统计学影响。6.补骨脂素给药干预一周后,与OVX组比较,0.8mg/kg E2组胃排空受到明显抑制(P<0.05),而补骨脂素各剂量组与OVX组比较没有统计差异;给药第二周时,与OVX组比较,0.8mg/kg E2及8mg/kg补骨脂素组,胃排空抑制明显(P<0.05),而此时4mg/kg及2mg/kg补骨脂素组仍未表现出抑制胃排空的作用;第三周:趋势同第二周,与OVX 比较,8mg/kg补骨脂素抑制胃排空(P<0.05),4mg/kg及2mg/kg补骨脂素对胃排空无影响;第四周:OVX组胃排空率较第一周有下降趋势;E2以及8mg/kg补骨脂素组仍表现为抑制胃排空效应(P<0.05)。然而,相对于0.8mg/kg剂量的E2,补骨脂素组ROS、MDA含量低,不会造成雌激素代谢压力。胃排空与体重有一定相关性,胃排空抑制可影响体重的增加。结论:1.生理状态下,高浓度E2(动情期)有抑制大鼠胃排空的作用,其作用机制是由ER α介导下调Rho/Rock2信号通路,抑制胃窦平滑肌收缩。2.当给予OVX大鼠高剂量(0.2mg/kg、0.8mg/kg)E2时,血清E2浓度超过生理水平,造成雌激素代谢压力,体内ROS及MDA累积,下调Rho/Rock2信号通路,这是病理状态下抑制胃排空的机制。3.补骨脂素作为拟雌激素的中药单体,具有调节胃排空的作用,8mg/kg补骨脂素在给药2周后开始出现抑制胃排空的作用,但不会造成机体雌激素的代谢压力。