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背景:炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一类多种病因引起的异常免疫介导的肠道慢性及复发性炎症性疾病。由于其病程反复、难治愈、易恶化致癌等问题,IBD已经成为人类生活的巨大负担。新的证据表明,NLRP3炎症小体作为固有免疫的重要组分在机体免疫反应IBD发生过程中具有重要作用。因此,在最新机制发现的启发下,寻找创新的、高效、低毒性的抗结肠炎药物是IBD治疗的当务之急。天然产物具有治疗范围广,副作用小,价格低等优点,一直是人们作为抗炎药物研究的重点。白头翁汤（Bai-Tou-Weng-Tang,BTWT）是中医治疗炎症引起肠道疾病的著名方剂,具有凉血止痢、清热解毒之功效,根据适应症,临床上常用于治疗肠炎、原虫性痢疾、细菌性痢疾等消化系统感染。BTWT的主要成分是白头翁,其中白头翁皂苷B4（Anemoside B4,AB4）是从白头翁的根中分离得到的一种主要的天然皂苷成分。既往研究表明,AB4通过抑制NF-κB的表达并降低炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平来减轻IBD的炎性损伤,但是否通过调控NLRP3炎症小体的表达来影响IBD炎症反应的研究尚未报道。CD1d与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）分子具有结构和功能同源性,可以传递相互信号,触发内源性信号。我们最近的一项工作表明,炎症过程中巨噬细胞CD1d信号通路抑制NLRP3炎症小体的活化。因此,通过调控CD1d信号通路来调节炎症因子的表达可能有益于NLRP3介导的IBD的治疗。目的:从巨噬细胞CD1d/NLRP3轴的角度出发,探讨了AB4对DSS诱导的IBD的保护作用及其相关的分子机制,为开发新型的IBD治疗药物以及治疗策略奠定理论基础。方法:1.CCK-8法检测AB4,AA3,23-HA（25μM、50μM、100μM、200μM）三种主要的白头翁皂苷单体对RAW264.7细胞活力的影响;q RT-PCR和ELISA检测三种皂苷单体对炎性因子IL-1βm RNA和蛋白的影响。2.构建3.0%DSS诱导的C57BL/6小鼠急性结肠炎模型,每天记录并分析小鼠的生存率、体重变化、DAI评分、结肠长度、脾脏指数;FITC-dextran检测肠通透性以及Western Blot检测肠紧密连接蛋白（Occludin,Claudin-1,ZO-1）的表达;H＆E染色及F4/80+免疫荧光检测结肠组织损伤情况。3.ELISA检测血清中炎性因子（IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、i NOS）的分泌;q RT-PCR、Western Blot检测NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18的m RNA和蛋白以及IL-10,IL-22、PCNA蛋白的表达;分离结肠巨噬细胞和肠上皮细胞,Western Blot、ELISA检测NLRP3炎症小体相关组分的蛋白表达;构建3.0%DSS诱导的C57BL/6和NLRP3-/-小鼠急性结肠炎模型:WT、WT+DSS、WT+DSS+AB4（15mg/kg）、NLRP3-/-、NLRP3-/-+DSS、NLRP3-/-+DSS+AB4（15mg/kg）,每天记录并分析小鼠体重变化、DAI评分、结肠长度;H＆E染色检测结肠组织损伤情况。LPS诱导BMDMs的体外模型,q RT-PCR检测NLRP3炎症小体相关组分的m RNA表达,同时Western Blot检测NLRP3、pro IL-1β、IL-18的蛋白表达;Western Blot、ELISA检测了AB4对LPS+ATP或LPS+Nigericin诱导BMDMs或THP-1细胞NLRP3炎症小体的影响。4.LPS诱导BMDMs和THP-1细胞体外模型,Western Blot检测AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB相关蛋白的表达;联合应用NF-κB抑制剂JSH-23检测NLRP3、pro IL-1β、IL-18的蛋白和m RNA的表达;联合应用AKT抑制剂MK2206以及AKT激动剂SC79检测相关通路蛋白的变化;构建3.0%DSS诱导的C57BL/6小鼠急性结肠炎模型,Western Blot检测小鼠体内AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB信号通路相关蛋白的表达;分子动力学模拟,评估AB4和CD1d的稳定性;构建3.0%DSS诱导的C57BL/6小鼠肠炎模型,Western Blot检测AB4对小鼠结肠CD1d蛋白的影响;构建3.0%DSS诱导的C57BL/6和CD1d巨噬细胞特异性敲除小鼠急性结肠炎模型:WT、WT+DSS、WT+DSS+AB4（15mg/kg）、CD1d-/-、CD1d-/-+DSS、CD1d-/-+DSS+AB4（15mg/kg）每天记录并分析小鼠体重变化、DAI评分、结肠长度;H＆E染色及F4/80+免疫荧光检测结肠组织损伤情况。Western Blot及ELISA检测AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB-NLRP3信号通路相关蛋白的表达。结果:1.AB4、AA3（25μM、50μM、100μM、200μM）对RAW264.7细胞均没有毒性作用,而200μM23-HA对RAW264.7细胞有一定的毒性作用;AB4（50μM、100μM、200μM）对IL-1βm RNA的抑制率分别为20%、32%、46%,而25μM的AB4对IL-1βm RNA的抑制作用没有统计学差异;AA3（50μM、100μM、200μM）对IL-1βm RNA的抑制率分别为12%、16%、26%,而25μM的AA3对IL-1βm RNA无抑制作用;23-HA（25μM、50μM、100μM）对IL-1βm RNA的抑制率分别为12%、17%、26%;50μM的AB4、AA3和25μM 23-HA均可抑制IL-1β的蛋白表达,并且AB4的抑制活性最高。2.在小鼠体内实验,与DSS组相比,AB4组小鼠生存率明显提高;体重降低不明显,DAI评分较低,结肠缩短不明显,脾脏指数较高;AB4组小鼠血清中FITC-dextran含量较低;AB4显著提高了Occludin,Claudin-1,ZO-1的蛋白表达;染色结果显示AB4减少了隐窝数量、炎性细胞浸润、结肠损伤及F4/80+巨噬细胞分布。3.在小鼠体内实验,与DSS组相比,AB4显著降低血清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、i NOS的水平;AB4抑制结肠中NLRP3炎症小体活化,上调IL-10,IL-22和PCNA的表达;AB4抑制结肠中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-αm RNA的表达;AB4抑制了结肠巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化,而不是肠上皮细胞。在DSS诱导的WT和NLRP3-/-小鼠结肠炎模型,与WT相比,NLRP3-/-小鼠的体重下降缓慢、DAI评分较低、结肠较长、结肠损伤较轻,NLRP3-/-+DSS+AB4与WT+DSS+AB4组具有相似性,未见显著差异。在LPS诱导的BMDMs细胞模型中,AB4显著抑制NLRP3、IL-1β、IL-18的m RNA表达,但不影响ASC、Caspase-1的m RNA表达;AB4显著抑制NLRP3、pro IL-1β、IL-18的蛋白表达。在LPS+ATP或LPS+Nig诱导的BMDMs和THP-1细胞体外模型中,AB4抑制了NLRP3、Caspase-1 p20、IL-1βp17、IL-18的蛋白表达。4.在LPS诱导的BMDMs和THP-1细胞模型中,AB4显著抑制AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB通路相关蛋白的表达;NF-κB抑制剂JSH-23抑制NLRP3、pro IL-1β、IL-18的蛋白和m RNA表达,与AB4具有作用相似性;AKT抑制剂MK2206抑制AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB信号通路相关蛋白以及NLRP3、pro IL-1β、IL-18蛋白的表达,与AB4具有作用相似性,而AKT激动剂SC79逆转了AB4对AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB信号通路相关蛋白以及NLRP3、pro IL-1β、IL-18蛋白的抑制作用;在3.0%DSS诱导的C57BL/6小鼠肠炎模型中,AB4抑制AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB信号通路相关蛋白的表达。AB4与CD1d具有较强的结合活性;在3.0%DSS诱导的肠炎模型中,AB4显著增强小鼠结肠组织CD1d的蛋白表达。在3.0%DSS诱导的WT和CD1d-/-小鼠肠炎模型中,与WT相比,CD1d-/-小鼠的体重下降、DAI评分、结肠缩短、结肠损伤及F4/80+巨噬细胞分布较为严重;CD1d巨噬细胞特异性敲除逆转了AB4对小鼠急性结肠炎的保护作用。Western Blot及ELISA结果显示CD1d巨噬细胞特异性敲除逆转了AB4对AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB-NLRP3信号通路相关蛋白的抑制作用。结论:1.AB4,AA3,23-HA三种白头翁皂苷单体中AB4在LPS诱导的巨噬细胞中抗炎效果最强。2.AB4可减轻DSS诱导的小鼠体重下降、降低DAI评分、提高生存率、增加结肠长度、降低脾脏指数、减轻肠上皮屏障损伤,进而减轻DSS诱导的小鼠炎症性肠病的炎性损伤。3.AB4抑制DSS诱导的小鼠结肠组织及结肠巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活,在DSS诱导的NLRP3-/-小鼠中进一步证实AB4通过抑制NLRP3炎症小体的激活来减轻IBD的炎性损伤;AB4在体外抑制NLRP3炎症小体的激活。4.AB4通过靶向巨噬细胞CD1d调控AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体的激活。CD1d巨噬细胞特异性敲除逆转了AB4对DSS诱导的小鼠体重下降、DAI评分、结肠缩短、结肠损伤的保护作用,也逆转了AB4对AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB-NLRP3信号通路的抑制作用。由此,我们得出白头翁皂苷B4可能通过靶向巨噬细胞CD1d调控AKT-STAT1-PRDX1-NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体的激活,促进炎症因子平衡及肠上皮损伤修复,维持粘膜屏障完整从而减轻DSS诱导的小鼠炎症性肠病的炎性损伤。